[发明专利]一种重组Vip3 Aa蛋白的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种Vip3 Aa蛋白在防治美洲大蠊或德国小蠊中的应用，其特征在于，所述Vip3 Aa蛋白的制备方法，包括下述步骤：

1）Vip3 Aa基因的克隆：

以Vip3 Aa DNA为模板，参考序列GenBank：L48811.1，Bacillus thuringienisstrainAB88 insecticidal protein设计引物进行PCR反应，引入BamH I和Xho I酶切位点；

2）Vip3 Aa/pET21b表达载体的构建和鉴定：

将PCR产物和原核表达质粒pET21b分别采用限制性内切酶BamH I和Xho I进行双酶切，采用DNA纯化回收试剂盒回收酶切片段，全波长分光光度计检测回收产物浓度并计算酶切片段摩尔数，以目的基因：表达载体摩尔比为 3：1，通过T4连接酶进行连接反应构建得到Vip3 Aa/pET21b表达载体；

3）Vip3 Aa/pET21b/BL21重组菌株的获得:

向100μL E.coil BL21感受态中加入10μL提取鉴定为阳性的Vip3 Aa/pET21b表达载体，轻弹混匀后冰上放置30min，金属浴 42℃下热击 90s，冰上放置 1min后向其中加入900μL LB培养基，37℃下低速振荡培养1h-1.5h；5000rpm离心去上清，将沉淀使用200μL LB培养基吹打均匀，均匀涂布于氨苄筛选平板；连续培养16-18h后，挑取单菌落进行菌落PCR和酶切鉴定获得Vip3 Aa/pET21b /BL21重组菌株；

4）重组菌株的诱导表达:

挑取Vip3 Aa/pET21b/BL21重组菌株单菌落接种于5mL含有100μg/mL氨苄的 LB 液体培养基中，37℃ 180rpm条件下震荡培养12-16h，将此菌液按1：100的比例接种于新鲜的LB液体培养基中，37℃ 180rpm条件下震荡培养至OD600值为0.6，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，20℃，180rpm条件下继续震荡培养24h；

5）Vip3 Aa蛋白的分离纯化和冷冻干燥:

将诱导表达的Vip3 Aa/pET21b/BL21重组菌株12000rpm离心10min，收集菌体，PBS洗涤离心；按每升培养液加入40mL比例加入裂解缓冲液悬浮菌体，加入PMSF和1％曲拉通X-100，采用超声细胞破碎仪破碎12min，细胞破碎后，12000rpm离心30min，取上清进行 SDS-PAGE；

Vip3 Aa/pET21b菌株破碎后上清液采用0.22μM滤器过滤，吸取10ml Vip3 Aa/pET21b菌株破碎后上清液上层析柱，采用五倍柱体积的2％咪唑的Blinding buffer对层析柱进行平衡，然后进行线性梯度洗脱；

Vip3 Aa蛋白脱盐及冷冻干燥：将脱盐柱和层析系统相连，以4mL/min去离子水冲洗5个柱体积，5倍柱体积的0.15M NaCl缓冲液对层析柱进行平衡，采用2mL 上样环上样，采用脱盐程序脱盐，收集脱盐的样品溶液，置于-80℃冷冻2h，冷冻干燥仪预冷至-40℃，冷冻干燥48h 即得Vip3 Aa蛋白；

所述步骤 2）中连接反应阳性产物的鉴定方法为：100μL DH5α感受态加入10μL连接产物，轻弹混匀，冰上放置30min，金属浴42℃热击90s，冰上放置1min，加入900μL LB培养基，37℃低速振荡培养1h-1.5h；5000rpm离心，去上清，保留200μL培养基吹打均匀沉淀，均匀涂布于氨苄筛选平板，16-18h后，挑取单菌落进行菌落PCR和酶切鉴定；

所述步骤1）中PCR反应的正向引物为SEQ ID NO.3所示，PCR反应的反向引物为SEQ IDNO.4 所示；所述步骤5）中裂解缓冲液的组成为25mmol·L^-1 Tris-HCl，300mmol·L^-1NaCl，5mmol·L^-1β-巯基乙醇，pH8.0。