[发明专利]一种Wnt/β-catenin信号通路影响斑马鱼侧线毛细胞再生的方法

说明书

本发明公开了一种Wnt/β‑catenin信号通路影响斑马鱼侧线毛细胞再生的方法，所述方法通过流式细胞分选斑马鱼侧线神经丘助细胞、荧光定量PCR、整胚原位杂交以及外源添加Wnt/β‑catenin信号通路小分子化合物抑制剂和增强剂的方法，观察顺铂诱导毛细胞损伤过程中Wnt/β‑catenin信号通路各因子的时空表达情况及毛细胞再生情况变化，对模式动物斑马鱼侧线毛细胞再生进行影响，Wnt/β‑catenin信号因子在顺铂诱导毛细胞死亡过程中表达量升高，包括配体wnt2、wnt3a及关键因子ctnnb1在侧线神经丘助细胞类群表达量升高；dkk1a和dkk2在助细胞类群表达量降低，这说明了在毛细胞死亡时，Wnt/β‑catenin信号通路活化。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种Wnt/β-catenin信号通路影响斑马鱼侧线毛细胞再生的方法。

背景技术

Wnt/β-catenin信号通路即Wingless-Int(Wnt)/β-catenin信号通路，是公认的细胞增殖和分化调节因子。在Wnt/β-catenin信号通路中，Wnts配体结合Frizzled受体和Lrp5/Lrp6辅助受体后通过招募Dishevelled活化受体复合物，解聚β-catenin降解复合体(GSK3β起主要调节作用)后，最终使β-catenin在细胞质内累积并进入细胞核与TCF/LEF一起激活下游因子表达。Kawakami等发现抑制Wnt/β-catenin信号通路导致斑马鱼、美西螈、非洲爪蟾和鸡等脊椎动物肢体再生障碍。Wnt/β-catenin信号通路同样控制着斑马鱼视网膜再生前体细胞的增殖。当用新霉素杀死斑马鱼侧线毛细胞后，增强Wnt/β-catenin信号通路显著增加侧线神经丘助细胞增殖和毛细胞形成。但是目前仍缺少对Wnt/β-catenin信号在毛细胞再生程序启动早期的关注。

顺铂的抗肿瘤作用发现30余年以来，其同后来衍生出的铂类化合物成为抗肿瘤治疗的一线用药。但是顺铂类化合物的耳毒性也是有目共睹的。研究者通过大样本数据回归分析发现，5岁以下的儿童尤其对顺铂诱发的耳聋敏感，当顺铂累积使用量达400mg/m²后，40％5岁以下儿童癌症患者表现出中度至重度的听力丢失，而年龄在15-20岁的对照组仅有5％表现出听力丢失的现象。目前研究认为在癌细胞和毛细胞中，顺铂可和DNA碱基共价结合，引起DNA链内或链间交联，诱发细胞凋亡。因此建立符合临床特点的顺铂损伤毛细胞模型是探究顺铂诱发听力障碍治疗的基础。

斑马鱼侧线毛细胞可被多种耳毒性药物杀死，研究发现，氨基糖苷类抗生素、顺铂类治癌药物和重金属离子铜等都可特异性的杀死侧线毛细胞。对氨基糖苷类药物来说，目前研究认为它们可以引起线粒体肿胀和胞内Ca²⁺浓度的瞬时增加。重金属离子铜离子以细胞凋亡和坏死结合的方式杀死侧线毛细胞。顺铂类药物在杀死侧线毛细胞过程中可使毛细胞的细胞核固缩，断裂成核小片段。我们前期研究结果发现，顺铂在杀死斑马鱼侧线毛细胞过程中可引起Caspase-3活化，这说明顺铂是通过细胞凋亡诱导毛细胞死亡。Piotrowski和Hudspeth研究组分别利用分选的斑马鱼侧线神经丘助细胞类群进行转录组高通量测序分析，发现Wnt/β-catenin信号通路相关基因不参与新霉素和硫酸铜诱导毛细胞死亡后的助细胞早期响应。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种能够影响斑马鱼侧线毛细胞再生的方法，本发明所解决技术问题是提供一种Wnt/β-catenin信号通路影响斑马鱼侧线毛细胞再生的方法。

本发明的技术方案是：