[发明专利]一种Wnt/β-catenin信号通路影响斑马鱼侧线毛细胞再生的方法

权利要求书

1.一种Wnt/β-catenin信号通路影响斑马鱼侧线毛细胞再生的方法，其特征在于：所述方法通过流式细胞分选斑马鱼侧线神经丘助细胞、荧光定量PCR、整胚原位杂交以及外源添加Wnt/β-catenin信号通路小分子化合物抑制剂和增强剂的方法，观察顺铂诱导毛细胞损伤过程中Wnt/β-catenin信号通路各因子的时空表达情况及毛细胞再生情况变化，对模式动物斑马鱼侧线毛细胞再生进行影响，所述顺铂浓度为1mM，所述流式细胞分选斑马鱼侧线神经丘助细胞方法具体为：收集5天转基因鱼SqET10顺铂处理3小时的样本，冰上麻醉后，用刀片切除耳泡以前的头部组织，将躯干组织转移到无钙Ringer’s溶液中，以5min为间隔用200μL枪头上下吹打样本15min以去除卵黄，将去除卵黄的样本转移至含有1mM EDTA0.25％Trypsin溶液中，28.5℃处理20～30min，其间每隔5min用1mL枪头来回吹吸，帮助组织解散成单细胞悬液，加入10％FBS和1mM CaCl₂终止酶促分解反应，收集细胞悬液，1000rpm离心5min，1 x PBS清洗2次，最后重悬于500μL PBS溶液中，用BD Aria II流式细胞分选仪分选GFP阳性细胞，细胞接收液为PBS(1x)，将分选所得的溶液离心，1000rpm，5min，去除上清后，直接加入Trizol-80℃保存；所述头部组织需要去除头部侧线组织；所述无钙Ringer’s溶液配方为116mM Nacl+2.9mM Kcl+5mM pH7.2HEPES；所述荧光定量PCR方法为Trizol提取分选细胞总RNA，用M-MLV第一链合成体系逆转成cDNA模板，β-actin为内参基因；所述QPCR所用的试剂盒为Green Quantitative RT-qPCR Kit；所述毛细胞再生的计数方法为10～15条斑马鱼幼鱼放于1.5mL EP管中，加入500μL 2μM YO-PRO1毛细胞特异性活体染料，室温避光30min，回收染料，用新鲜的养鱼水润洗幼鱼3次即可，用0.016％质量体积比麻醉剂麻醉后，在Zeiss Axio A1倒置荧光显微镜计数侧线神经丘毛细胞数。

2.根据权利要求1所述的Wnt/β-catenin信号通路影响斑马鱼侧线毛细胞再生的方法，其特征在于：所述整胚原位杂交方法为取10条斑马鱼样本，4％PFA固定过夜，加入地高辛标记的反义链探针孵育过夜保证探针充分结合，第二天加入碱性磷酸酶偶联二抗室温孵育4-5小时，后加入BCIP和NBT底物避光显色。