[发明专利]一种高效NK细胞培养方法

说明书

本发明公开了一种高效NK细胞培养方法，本发明的培养方法分离培养的NK细胞的数量足，扩增快，一般外周血培养15天，能够达到70亿个细胞；本发明通过培养基中添加乙酰化α葡聚糖作为激活调动剂，成功激活了NK细胞，促使其分泌IL2、IL12和IFN‑γ，而IL2、IL12和IFN‑γ在NK细胞活化后维持其活性和扩增速率起到关键的作用，使其更具有临床应用价值；此外，本发明方法获得NK细胞的纯度高，对流式细胞仪的检测结果进行分析，发现CD3^‑CD56⁺的NK细胞数达到80％以上，满足临床应用的要求。

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种高效NK细胞培养方法。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)是机体重要的免疫细胞，主要分布于外周血中，占PBMC的5％-10％，淋巴结和骨髓中也有NK活性，但水平较外周血低。NK细胞是一群异质性、多功能的免疫细胞，是人类的众多免疫细胞中的一种，表现为自然细胞毒活性的杀伤细胞。主要作用消灭攻击人类身体的病毒、细菌、癌细胞等。发挥作用的方式分为：直接杀伤、释放穿孔素、NK细胞毒因子和TNF等。每个人的身体里至少有50亿个NK细胞，多则达到1000亿个。但NK细胞的数量和其活动力不是成正比的。即使NK细胞显示有足够的数量，但是不激活他们，他们的工作效率也是非常低的。

目前，国内外已经有大量的研究者进行了人NK细胞的培养和生物治疗方面的研究，但多数研究都是单纯利用IL-2和IL-12等白介素类细胞因子去培养，但是这样获得的结果往往有两个弊端，要么是数量上不去，达不到治疗性回输所需的量，要么是纯度上不去，达不到应有的效果。因为白介素类细胞因子都不是强烈的NK细胞活化剂，缺乏强有力的活化作用。但是，当NK细胞被充分活化后，白介素类细胞因子对NK细胞的活性维持和增殖发挥了极为重要的作用。因此，获得高数量高纯度的NK细胞，首先需要充分活化NK细胞。

发明内容

本发明为解决现有技术中的上述问题提供一种区别于传统培养法的人NK细胞的培养方法，使之简单易行。本发明中培养获得的人NK细胞被活化，NK细胞分泌的IL2、IL12和IFN-γ的表达水平更高，细胞纯度高，生长良好，细胞增殖更快，且细胞得率和存活率均大大提高。

为了实现上述技术目的，本发明所采取的技术措施为：

一种高效NK细胞培养方法，包括以下步骤：

步骤1：用PBS稀释单克隆抗体CD16和CD2获得抗体稀释液，然后用抗体稀释液过夜包被细胞培养容器；

步骤2：分离单个核细胞；

步骤3：将步骤2获得的单个核细胞接种到培养容器中，从接种时间开始计时，每隔3天更换新鲜的细胞培养基，培养18天后收集细胞；所述的细胞培养基中含有乙酰化α葡聚糖。

为了优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：

优选地，上述的乙酰化α葡聚糖浓度为5-15mg/ml。

优选地，上述的细胞培养基，还含有10％knockout血清替代品和500U/ml的IL-2。

优选地，上述的10％knockout血清替代品还可以替换成人血小板裂解物。

优选地，上述的细胞培养基为CellGro SCGM或RPMI-1640培养基。

优选地，上述的培养容器为细胞培养瓶或细胞培养板，更优选为T75细胞培养瓶。

优选地，上述步骤2的接种细胞密度为2×10⁶/ml。

另一方面，本发明还提供根据上述的细胞培养方法培养得到的NK细胞及其在制备抗肿瘤药物中的应用。