[发明专利]人凝血因子Ⅷ制品中vWF多聚体的检测方法

说明书

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种人凝血因子FⅧ制品中血管性血友病因子多聚体的检测方法，依次包括胶制备、电泳、膜和滤纸处理、湿转、封闭、抗体孵育和显色等步骤，其特征在于：所述电泳步骤为连续垂直琼脂糖电泳，并在显色步骤后增加了定量分析步骤用以准确分析FⅧ制品中血管性血友病因子多聚体的质量。所述定量分析步骤为用凝胶分析软件计算供试品和混合血浆中每个条带相对含量，并以供试品中每个条带的相对含量与混合血浆中每个条带的相对含量的比值来做为评估血管性血友病因子多聚体质量的标准。本发明中可定量分析FⅧ制品中血管性血友病因子多聚体组成，从而评估FⅧ制品中vWF的质量，为FⅧ/vWF制品用于vWD的治疗提供理论依据。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及人凝血因子Ⅷ制品(Human CoagulationFactor Ⅷ，以下简称FⅧ制品，)中血管性血友病因子(von Willebrand Factor，以下简称vWF) 多聚体组成的检测方法。

背景技术

FⅧ制品是由健康人血浆分离提纯而来，以FⅧ为主要药物成分的血浆蛋白制品，在临床上主要用于治疗先天缺乏FⅧ的甲型血友病。而在生产过程中vWF与FⅧ不易分开，大部分FⅧ制品中都含有vWF，因此FⅧ制品也用于治疗von Willebrand病，一种vWF数量减少或质量异常导致的出血性疾病。FⅧ制品中的vWF主要有2个功能：一个是作为FⅧ的载体保护FⅧ不被降解，另一个是介导血小板黏附于损伤的血管壁并诱导血小板聚集，发挥止血功能。vWF在血浆中以多聚体形式存在，分为高分子量多聚体(含有11-20个二聚体)，中分子量多聚体(含有5-10个二聚体)和低分子量多聚体(含有1-5个二聚体)。

研究表明尽管所有分子量的vWF均有FⅧ载体功能，但vWF的止血功能与vWF多聚体分子量大小有关，只有高分子量vWF多聚体具有较强的血小板结合能力，中分子量vWF多聚体仅有较低的血小板结合能力，而低分子量vWF多聚体不具有与血小板结合的能力。因此用于治疗vWD的FⅧ制品必须含有高分子量和中分子量vWF多聚体。在评估FⅧ制品是否可用于治疗vWD时，需对FⅧ制品进行vWF多聚体分析。

传统的vWF多聚体分析方法常用SDS-琼脂糖电泳和Western blot来分析，包括以下几个步骤：(1)进行不连续水平板SDS-琼脂糖电泳，大约需6-8小时。(2)进行湿转移，电转时间12-20h。(3)进行一抗、二抗孵育和底物显色，大约需要16h。传统的vWF多聚体分析方法操作复杂、耗时长，需要3-5天，且未进行定量分析，因此不适合用于分析FⅧ制品中vWF多聚体组成。

发明内容

本发明的目的是克服现有检测技术所存在的上述不足，建立一种快速灵敏，可定量分析 FⅧ制品中vWF多聚体组成的方法，该方法适用于定量分析FⅧ制品中vWF多聚体组成；克服了传统方法中水平板琼脂糖电泳耗时长及不连续的垂直板琼脂糖电泳在制备过程中操作非常困难的技术问题。

解决以上技术问题的本发明中的一种人凝血因子Ⅷ制品中vWF多聚体的检测方法，依次包括胶制备、电泳、膜和滤纸处理、湿转、封闭、抗体孵育和显色步骤，其特征在于：所述电泳步骤为连续垂直琼脂糖电泳，并在显色步骤后增加了定量分析步骤用以准确分析FⅧ制品中vWF多聚体的质量。所述定量分析步骤为用凝胶分析软件计算供试品和混合血浆中每个条带相对含量，并以供试品中每个条带的相对含量与混合血浆中每个条带的相对含量的比值来做为评估vWF多聚体质量的标准。

本发明中方法为连续的垂直板琼脂糖电泳，容易操作，减少制胶步骤。

所述电泳步骤与膜和滤纸处理步骤之间还有浸泡洗涤步骤，即胶取出后，用1mMβ-巯基乙醇浸泡5min后用PBS-T洗3次，每次5min，在电泳缓冲液中放置15min。

电泳结束后，用β-巯基乙醇处理胶，使胶上所有条带都裂解为单体，再进行电转移，提高转膜效率。