[发明专利]人凝血因子Ⅷ制品中vWF多聚体的检测方法

权利要求书

1.一种人凝血因子Ⅷ制品中血管性血友病因子多聚体的检测方法，依次包括胶制备、电泳、膜和滤纸处理、湿转、封闭、抗体孵育和显色步骤，其特征在于：所述电泳为连续垂直琼脂糖电泳，并在显色步骤后增加了定量分析步骤用以准确分析人凝血因子Ⅷ制品中血管性血友病因子多聚体的质量；所述定量分析步骤为用凝胶分析软件计算供试品和混合血浆中每个条带相对含量，并以供试品中每个条带的相对含量与混合血浆中每个条带的相对含量的比值来作为评估血管性血友病因子多聚体质量的标准；

所述电泳为将处理好的样品加入上样孔，在电泳缓冲液中电泳；电泳条件为：恒流10mA, 2-2.5h，直至溴酚蓝跑出玻璃板，结束电泳；

所述电泳与所述膜和滤纸处理步骤之间还有浸泡洗涤步骤，即胶取出后，用1 mMβ-巯基乙醇浸泡5min后用PBS-T洗3次，每次5min,在冰冷的湿转缓冲液中放置15min；

所述定量分析步骤中，将供试品中第5条带之后的条带合在一起分析，并以混合血浆作为标准对照分析人凝血因子Ⅷ制品中血管性血友病因子多聚体组成，即用供试品中每个条带的相对含量与混合血浆中每个条带的相对含量的比值来评估血管性血友病因子多聚体的质量，用百分比表示来反映血管性血友病因子多聚体的质量。

2.根据权利要求1所述的一种人凝血因子Ⅷ制品中血管性血友病因子多聚体的检测方法，其特征在于：所述胶制备为将琼脂糖溶于缓冲液中，加热至沸腾，倒入垂直玻璃板中，插入梳子制造上样孔，放置一段时间待胶凝固。

3.根据权利要求2所述的一种人凝血因子Ⅷ制品中血管性血友病因子多聚体的检测方法，其特征在于：所述琼脂糖浓度为1%-1.2%，缓冲液为连续凝胶缓冲液，具体配方包括：30%甘油，50mM Tris，0.384M Gly和0.1%SDS。

4.根据权利要求1所述的一种人凝血因子Ⅷ制品中血管性血友病因子多聚体的检测方法，其特征在于：所述样品为待测的人凝血因子Ⅷ制品和作为标准对照的混合血浆；待测的人凝血因子Ⅷ制品和混合血浆用纯水将其稀释至血管性血友病因子抗原（vWF：Ag）含量1IU/ml，再与上样缓冲液按1:4的比例混合,最后加入溴酚蓝使其终浓度为0.005%；所述上样缓冲液包括9M尿素，4mM EDTA，50mM Tris，2% SDS, 上样缓冲液pH为6.8。

5.根据权利要求1所述的一种人凝血因子Ⅷ制品中血管性血友病因子多聚体的检测方法，其特征在于：所述电泳缓冲液的具体配方包括50mM Tris，0.384M Gly，0.1%SDS，电泳缓冲液pH为8.3；所述湿转缓冲液的具体配方包括2.5mM Tris, 19.2mM Gly，0.1%SDS，湿转缓冲液pH为8.8。

6.根据权利要求1所述的一种人凝血因子Ⅷ制品中血管性血友病因子多聚体的检测方法，其特征在于：所述显色步骤为PBS-T洗膜5次，每次5min；然后膜与发光试剂盒中混合液充分接触,采用超灵敏化学发光成像仪捕捉信号；将膜上有蛋白的那面朝下与发光试剂盒混合液充分接触30s-2min。