[发明专利]基于愈伤组织诱导建立马蔺高频再生体系方法

说明书

本发明涉及一种基于愈伤组织诱导建立马蔺高频再生体系方法，该方法以春季白花马蔺叶片为外植体，以MS为基本培养基，利用激动素(KT)、2,4二氯苯氧乙酸(2,4‑D)、萘乙酸(NAA)、6‑苄基腺嘌呤(6‑BA)、吲哆丁酸(IBA)激素调节，建立一种基于愈伤组织诱导建立马蔺高频再生体系的方法。该发明一个增殖继代周期为4‑5周，愈伤组织诱导率80％以上，愈伤组织不定芽诱导系数为8‑10倍，繁殖不受季节的影响，可极大提高种苗繁殖系数，保持原有优良性状，为该品种栽培、应用、生产提供科学、有效的繁殖方法，亦可为鸢尾属植物的工厂化生产繁殖提供参考。

技术领域

本发明涉及一种基于愈伤组织诱导建立马蔺高频再生体系方法。

背景技术

本发明涉及的白花马蔺(Iris.lactea Pall.)为鸢尾科鸢尾属多年生草本花卉，叶基生，灰绿色，条形或狭剑形；花乳白色，直径5-6厘米，花梗长4-7厘米；花期长5-6月；耐盐碱、耐践踏，根状茎粗壮，根系发达，可用于水土保持、改良盐碱土及脆弱生态环境；根、茎、花、种子均可入药，马蔺也是具有较高观赏价值的园林绿化景观材料。

但由于东北地区冬季寒冷漫长，夏季生长季短，城市绿化可利用的植物种类少，且绿化成本较高，尤其是黑龙江省，能够露地越冬的品种有限，因此大量繁育能够在我省露地越冬的优良品种，对丰富高寒地区园林绿化植物种类具有重要意义，由于马蔺分株繁殖速度较慢，增殖系数低，每年只能春季进行繁殖，需要的母本数量较多，不适合大批量生产栽培。由于此品种繁殖率低，分株繁殖速度较慢，增殖系数极低，每年仅能增殖2-4倍，因此影响了此品种的大批量生产及广泛应用，在园林彩化、绿化大面积应用过程中产业化生产受到限制，此发明方法为解决白花马蔺组培繁殖过程中从愈伤组织诱导不定芽从而提高不定芽扩繁系数提出了具体方法。

发明内容

本发明以优化再生体系为目的，以保持遗传稳定性为核心，提供一种基于愈伤组织诱导建立马蔺高频再生体系方法，以解决分株繁殖速度慢，增殖系数低，组培苗褐化、玻璃化等不能满足工厂化育苗需求的问题。为了实现上述目的，本发明的技术方案为：一种基于愈伤组织诱导建立马蔺高频再生体系方法，包括以下步骤：

1)外植体筛选：春季选择马蔺健康植株展开的叶片，选取叶片中间位置，剪下作为外植体；

2)外植体消毒：将叶片置于装有清水的200mL烧杯中，加入2-3滴洗洁精，烧杯口套上纱网后，采用自来水洗净后，加适量洗洁精在自来水处保持冲洗状态30-40分钟，用滤纸吸干水分；在烧杯中加入质量百分比浓度10％次氯酸钠溶液，使外植体材料完全浸泡其中，加入2滴吐温20(Tween20)制成消毒液，轻轻摇晃，15-20分钟后倒掉烧杯中所有消毒液，向烧杯中倒入经过高温高压灭菌的无菌水冲洗外植体材料4次，无菌水使用遵循先少后多原则，清洗至烧杯表面没有泡沫后，倒掉烧杯中无菌水，连带烧杯放置于超净工作台上；

3)接种：将消毒好的叶片材料用已消毒滤纸吸干，叶片切成小正方形，尺寸为：0.5cm×0.5cm，将切成小方形的叶片平行置于基本培养基MS上，培养时间15天，培养室内温度为24-26℃，一个昼夜中培养室内光照时间为12小时，培养室内黑暗时间12小时，光照强度为2000-2200Lux，Lux为：照度的国际单位；

4)愈伤组织不定芽诱导：筛选步骤3)中MS培养基中叶片无污染、叶片边缘膨大的部分，转接于第一培养基上，所述第一培养基构成为：基本培养基MS附加0.02mg/L萘乙酸(NAA)、2.0mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA)和1.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)；蔗糖30g/L；琼脂粉5g/L；pH6.0；培养30天，叶片诱导出绿色、致密的愈伤组织，培养45-50天时，叶片诱导的愈伤组织的芽点处长出许多不定芽，培养室内温度为24-26℃，一个昼夜中培养室内光照时间为12小时，培养室内黑暗时间12小时，光照强度为2000-2200Lux，Lux为：照度的国际单位；