[发明专利]敲除Toll样受体3(hTLR3)的A549细胞模型

说明书

本发明公开了一种敲除Toll样受体3(hTLR3)的A549细胞模型。本发明保护sgRNA组合，由如下两个sgRNA组成：sgRNA‑1和sgRNA‑2；所述sgRNA‑1的靶序列如序列表的序列7自5’端第435‑454位所示；所述sgRNA‑2的靶序列如序列表的序列7自5’端第794‑813位所示。本发明过CRISPR/cas9技术研究并阐明Knockout TLR3的A549细胞模型用于完善胞内信号转导途径及机制，并以此建立疾病细胞或动物模型，有助于对疾病的认识，从而寻找新的药物靶点，更好地为临床预防和治疗服务。

技术领域

本发明涉及生物技术和医学诊断领域，具体涉及一种敲除Toll样受体3(hTLR3)的A549细胞模型。

背景技术

免疫系统的最基本功能是识别外源抗原并诱导机体产生一系列反应清除外源致病性物质，以保持机体的稳定性。机体对病毒和细菌的初次免疫应答一般认为是非特异性的，但是，Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)的发现则说明机体可特异性识别病毒和细菌的免疫应答。天然免疫细胞所识别的主要靶分子称为病原相关的分子模式(pathogenassociated molecular patterns,PAMPs)，PAMPs是众多微生物共有的一种保守的模式分子，广泛存在于病原体细胞表面，如内毒素、肽聚糖、鞭毛蛋白、双链RNA以及酵母细胞壁上的甘露糖等。识别PAMPs的受体称为模式识别受体(pattern recognitionreceptor，PRRs)。TLRs分子即是一类重要的PRR，迄今已在哺乳类动物中发现10种TLR，称为TLR受体家族。

TLR3是Toll样受体(TLR)家族中的重要成员之一，是病毒双链RNA的模式特异性识别受体，通过独特的信号传导途径在抗感染、自身免疫性疾病、肿瘤等疾病的发生发展过程中重要作用，是疾病防治和药物开发的重要靶点。

TLR3最丰富的表达在胎盘和胰腺。TLR3识别配体后通过含TIR结构域的转接蛋白(TRIF)途径活化转录因子NF-κB和干扰素调节因子3(IRF3)，诱导炎症细胞释放炎症因子并介导炎症反应，同时诱导I型干扰素的释放，介导抗病毒天然免疫。单纯疱疹病毒性脑炎2由HSV-II型病毒引起，约占单纯疱疹病毒性脑炎6％～15％，HSV-2主要引起生殖器疱疹，由其所致HSE主要见于新生儿，分娩时生殖道分泌物与胎儿接触是导致新生儿感染的主要原因。HSV-2原发感染也见于年轻人，可通过性接触传播，引起成年人的无菌性脑膜炎。因此在这些病毒感染，如单纯疱疹病毒性脑炎2、人类免疫缺陷病毒-1等中，TLR3通过诱导组织损伤介导病毒的扩散从而加重疾病的严重程度。

人TLR3基因定位于4q35，其开放读码框有4个外显子编码，由2715核苷酸组成，编码由904个氨基酸组成蛋白质，其中前21个氨基酸组成信号肽，第21-904为成熟的TLR3分子。TLR3的信号传导包括两条途径，即髓样细胞分化因子88(MyD88)依赖和非依赖途径。MyD88依赖的信号传导途径是TLR信号传导的共同途径。在MyD88依赖性途径中，当相应配体同TLR结合后可促使受体发生二聚化，其胞质区通过TIR结构域募集MyD88，结合后引发的下游因子作用，主要包括以下几个方面：(1)MyD88与TLR胞内区的TIR区结合，作为接头蛋白募集IRAK(IL-1受体相关激酶)；(2)IRAK结合TNF受体相关因子6(TRAF6)从而活化TAK1；(3)TRAF6的活化引起两条不同途径的信号转导：一条包括p38MAPK家族和c-JunN-端激酶Jnk；另一条是包括Rel家族转录因子NF-κB的途径。此外，两个接头蛋白(TRIF或TICAM-1)能介导TLR3诱导的IFN-β的产生，所以该接头蛋白可能与MyD88非依赖的信号传导途径有关。