[发明专利]治疗子宫内膜损伤和卵巢早衰的子宫内膜干细胞及外泌体的联合制剂、制备方法与给药方法在审
申请号: | 201810304218.4 | 申请日: | 2018-04-04 |
公开(公告)号: | CN109893543A | 公开(公告)日: | 2019-06-18 |
发明(设计)人: | 鲁振宇;张冰晶;韩洪起;牟鑫煜;徐悦 | 申请(专利权)人: | 天津欣普赛尔生物医药科技有限公司 |
主分类号: | A61K35/48 | 分类号: | A61K35/48;A61P15/00;C12N5/071 |
代理公司: | 天津才智专利商标代理有限公司 12108 | 代理人: | 王晓红 |
地址: | 300400 天津市北*** | 国省代码: | 天津;12 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 子宫内膜 干细胞 回收 卵巢 生物活性物质 子宫内膜损伤 干细胞分泌 早衰 饥饿培养 联合制剂 给药 制备 宫内膜干细胞 梯度过滤 浓缩液 生物膜 分泌 治疗 浓缩 | ||
本发明公开了一种治疗子宫内膜损伤和卵巢早衰的子宫内膜干细胞及外泌体的联合制剂和其制备方法与给药方法。包括子宫内膜干细胞以及通过饥饿培养获得子宫内膜干细胞外泌体浓缩液。通过对子宫内膜干细胞饥饿培养的方法,促进其生物活性物质的分泌。以外泌体的形式回收子宫内膜干细胞分泌的生物活性物质,大大提高了回收效率、回收方式更为简便。通过不同孔径的生物膜梯度过滤的方法,收集并浓缩子宫内膜干细胞分泌的外泌体,简化了外泌体回收的流程,提高了外泌体的纯度。
技术领域
本发明涉及子宫内膜干细胞及其外泌体的联合制剂,尤其是一种治疗子宫内膜损伤和卵巢早衰的子宫内膜干细胞及外泌体的联合制剂、制备方法与给药方法。
背景技术
子宫内膜损伤主要为内膜基底层的损伤,其主要原因与妊娠期刮宫有关,与正常子宫内膜相比,妊娠期子宫内膜基底层疏松,更容易受到损伤。基于我国国情以及人工流产率逐渐增加的现状,子宫内膜受损的发生情况不容忽视。子宫内膜基底层受损,可能导致子宫内膜干细胞受损或缺失;与此同时,损伤内膜局部的感染和无菌性炎症会破坏干细胞的壁龛微环境,造成上皮和间质细胞再生修复发生障碍,血管形成受阻,致密纤维组织形成,最终导致宫腔仅覆盖少量内膜,甚至无内膜,腺体萎缩,宫腔失去正常形态及功能。
子宫内膜干细胞属于成体干细胞,具有多向分化、组织修复、免疫调节等多种功能,在临床应用中具有极大的优势。研究显示,子宫内膜干细胞能够一定程度上治疗和缓解子宫内膜损伤。但是,直接静脉回输脐带子宫内膜干细胞由于细胞难于到达子宫部位,所以治疗效果有限。
研究发现,干细胞行使生物学功能的一个最重要途径是通过分泌大量生物活性因子,进而调节病变组织的机能、促进血管再生、加速组织再生修复。而大量的生物活性因子的分泌途径主要是通过外泌体,一种生物膜包括的,直径在40-200nm不等的分泌小泡。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是,提供一种治疗子宫内膜损伤和卵巢早衰的子宫内膜干细胞及外泌体的联合制剂、制备方法与给药方法,通过饥饿培养子宫内膜干细胞并进行富集浓缩的方法,获得高浓度的具有生物活性的子宫内膜干细胞外泌体,将外泌体与子宫内膜干细胞联合制备制剂通过直接注射入子宫内部用于治疗子宫内膜损伤。
为了解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是:一种用于治疗子宫内膜损伤和卵巢早衰的子宫内膜干细胞及其外泌体的联合制剂的制备方法,包括以下步骤:
(1)人子宫内膜干细胞的培养:选取生长状态良好的,微生物检测均为阴性的,P2-P8的人源子宫内膜干细胞,按照3-5*104/cm2的初始密度接种于细胞培养瓶或细胞培养皿中,培养基为基础培养基中含有体积比浓度5-15%的胎牛血清的培养体系;
(2)接种培养2-4天后,细胞融合率达到80-95%,细胞生长状态良好,吸弃全部培养上清,并以医用复方电解质注射液清洗细胞2-4次,然后加入适量复方电解质溶液,使溶液高度达到2-3mm,放入二氧化碳培养箱中饥饿培养;
(3)饥饿培养18-30h后,回收全部培养上清,以0.22um孔径滤膜过滤,过滤后的培养上清在3000-5000g的离心力条件下离心10-20min,再次回收离心上清;
(4)在200000-500000g的离心力条件下对回收的上清离心30-60min,离心后轻轻取出离心管,以移液管吸弃上部70%-90%体积的液体,将下部10%-30%体积的液体及沉淀混合均匀后作为制备子宫内膜治疗制剂的外泌体溶剂,在2-8℃条件下保存;
(5)人子宫内膜干细胞的培养:选取生长状态良好的,微生物检测均为阴性的,P2-P8的人源子宫内膜干细胞,按照3-5*104/cm2的初始密度接种于细胞培养瓶或细胞培养皿中,培养基为基础培养基中含有体积比浓度5-15%的胎牛血清的培养体系;
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