[发明专利]一种牡蛎细胞凋亡基因SMAC基因及其在制备病理检测诊断试剂中的应用

说明书

本发明公开一种牡蛎细胞凋亡基因SMAC基因及其在制备病理检测诊断试剂中的应用。本发明发现了该物种细胞凋亡的标志性基因SMAC基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第50至1006bp所示。该基因编码的氨基酸序列(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)具有高度的物种特异性，在牡蛎属内氨基酸序列的相似性在60％‑88％，进化关系比较近，而与其他物种同源蛋白的相似性则在30％以下，因而进化关系比较远。定量PCR实验表明，SMAC基因在溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)感染后显著上调，可以作为检测牡蛎细胞凋亡情况的标准，对于牡蛎疾病的预防提供一个积极而准确的警戒信号，防止了灾害的扩大。

技术领域：

本发明涉及贝类免疫与细胞凋亡的分子机理，更具体涉及一种从弧菌刺激后的香港巨牡蛎(Crassostrea hongkongensis)血细胞差减杂交文库中筛选出来的SMAC(secondmitochondria -derived activator of caspases)基因的核苷酸序列、氨基酸序列及其制备方法和该基因的用途。

背景技术：

我国是世界上最大的牡蛎养殖国家，据统计，其年产量占世界总产量的80％以上。依据2015中国渔业统计年鉴统计，该年度牡蛎的养殖面积达到14.15万公顷，产量约为457.34万吨，因此，牡蛎的养殖在我国沿海经济社会发展中占据举足轻重的地位，是一个重要的支柱产业；香港巨牡蛎主要分布在我国广西至福建的部分沿海河口和海湾区域,是华南沿岸的最重要的牡蛎养殖品种。我国海洋贝类的发展是以传统养殖为主，养殖面积广、能耗高的，产量因各种条件变化而波动，而且，由于缺乏有效的疾病检测手段，随着养殖规模的扩大，对于牡蛎养殖的风险也越来越大。在牡蛎养殖中，大规模死亡事件频繁发生，其死亡率高达70％-80％，有的养殖场的几乎全部死光。引起牡蛎死亡的原因很多，其中致病菌及寄生虫的侵害加重了牡蛎死亡情况，而恶劣的环境胁迫，也是诱导牡蛎死亡的一个重要因素。因此，建立实时的牡蛎养殖病害的预防和监测机制，是人们所亟待解决的问题之一。

细胞凋亡是检测个体生存状态的一个重要的标志，而任何胁迫在机体内的反应，都可能使细胞凋亡这一生理机制活化，因而，细胞凋亡标志性基因的遴选，对于建立机理预防机制具有重要的意义。SMAC(second mitochondria-derived activator of caspases)是细胞凋亡的标志性基因，是指线粒体内除细胞色素C外，第二个被发现的通过激活半胱氨酸蛋白酶Caspases来调节细胞凋亡的蛋白。细胞内含有大量的Caspases，它们的活性位点均包含半胱氨酸残基，能够特异性的切割靶蛋白天冬氨酸残基上的肽键，从而诱导细胞凋亡。正常条件下，细胞质中的Caspases蛋白与凋亡抑制蛋白IAPs(inhibit apoptosisproteins)结合，维持细胞的稳定结构，不会活化细胞凋亡。在某些情况下，细胞接到凋亡信号时，SMAC会从线粒体释放至细胞质，与IAPs结合，使其丧失caspase抑制活性，活化Caspases蛋白，从而启动细胞的凋亡，因此，检测胞质内SMAC是判定细胞凋亡的金标准。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种贝类细胞凋亡相关的基因序列-SMAC基因。

本发明的贝类细胞凋亡相关的基因序列-SMAC基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第50至1006bp所示，其编码318个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。