[发明专利]一种用于光动力抗菌的EPS-RB纳米颗粒的合成方法

说明书

本发明公开了一种用于光动力抗菌的EPS‑RB纳米颗粒的合成方法，以植物乳杆菌胞外多糖EPS、玫瑰红RB、1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳化二亚胺盐酸盐EDC‑HCl和N‑羟基琥珀酰亚胺NHS为原料，在二甲基亚砜DMSO中反应获得复合物EPS‑RB；复合物EPS‑RB在水溶液中自组装形成球形纳米颗粒，并具有优良的光动力抗菌效果。该复合物在溶液中可以自聚集形成纳米颗粒。该纳米颗粒在光照条件下产生高于游离RB的单线态氧，使其对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的光动力抗菌优于游离RB。EPS‑RB纳米颗粒完全杀死大肠杆菌和金黄色葡萄球菌所需浓度为分别为8μM和500nM，而游离RB则分别需要16μM和1000nM。

技术领域

本发明属于生物技术和纳米材料领域，具体涉及一种利用植物乳杆菌胞外多糖和光敏剂玫瑰红(Rose Bengal)化学合成用于光动力抗菌的纳米颗粒。

背景技术

光动力治疗(PDT)为抗癌(Nanoscale 2012,4,7712-7719)和抗菌(Small 2016,12,3609-3644)提供了一种有效策略。光动力治疗的原理是光敏剂在有光存在的情况下产生活性氧(ROSs)，主要是单线态氧以及一些自由基，引起细胞凋亡或坏死以及破坏组织(Photodiagn.Photodyn.Ther.2004,1,279-293)。光动力抗菌可替代传统抗生素，并避免产生耐药性(Photodiagn.Photodyn.Ther.2009,6,170-188)。有报道称耐药细菌和非耐药细菌对PDT一样敏感(Angew.Chem.,Int.Ed.2015,54,15367-15370)，这使得PDT成为抗耐药细菌的有效手段。此外，PDT是通过产生ROS不可逆的破坏细胞内重要的生物分子(Chem.Soc.Rev.2010,39,2835-2846)，包括DNA、蛋白质和脂质，因而不会产生抗药性(Photobiol.Science.2004,3,436-450)。由于单线态氧以及其他自由基的高活性以及极短的半衰期，PDT只能直接作用于光敏剂临近的分子或结构。单线态氧的半衰期0.04μs，在生物系统内的活动半径0.02μm(Photochem.Photobiol.1991,53,549-553)，因此，光敏剂的定位极大程度的决定了PDT的抗菌效果。人们期望光敏剂可以锚定到细胞膜或渗透到细胞内部以获得较优的光动力抗菌效果。但是大部分光敏剂是疏水的，无法靶向到细胞膜或进入细胞内部(Antimicrob.Agents Chemother.2011,55,1883-1890)。为解决该问题，光敏剂通常通过物理包裹和化学交联法与其他纳米载体如金属纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、上转化纳米颗粒、胶束和脂质体等等联用。这些通常是基于电荷相互作用、疏水相互作用和共价交联的细胞表面工程完成的，往往存在一些缺点，例如：细胞毒性大、修饰方法复杂、生物相容性低以及抗菌效果不佳等。

PDT的另外一个缺点是对于革兰氏阴性菌的抗菌效果不如革兰氏阳性菌(Biomaterials 2013,34,3503-3510)。与革兰氏阳性菌和动物细胞相比，革兰氏阴性菌细胞壁外围还有一层外膜结构，会阻碍大部分药物进入到细胞内部(J.Appl.Microbiol.2013,114,36-43)。人们也发展了许多提高PDT对阴性菌的抗菌效力的方法。直接的方法是使用细胞膜破坏试剂，比如用甲苯或金属离子螯合剂EDTA预先处理革兰氏阴性菌，增强其外膜的通透性，以增加光敏剂作用于革兰氏阴性菌的光动力效果。另一种克服光敏剂很难进入革兰氏阴性菌细胞的办法是将光敏剂和带正电荷的物质联合使用，如亚甲基蓝、甲苯胺蓝O和阳离子共轭聚合物；或者将光敏剂与带正电荷的聚合物如多粘菌素B、聚-L-赖氨酸和聚乙烯亚胺共价接枝。通过静电相互作用，这些阳离子试剂能有效地结合到带负电荷的革兰氏阴性菌细胞外表面，增强PDT抗菌效果。尽管如此，这些策略存在细胞毒性大以及生物相容性差等缺点，亟待开发更安全的抗阴性菌PDT策略。

RB是一种疏水的、表面带负电荷的氧化蒽染料，常被用于光动力抗菌中的光敏剂。与前面提到的疏水光敏剂一样，RB抗革兰氏阴性菌效果差，限制了它的实际应用。因此，人们需要对RB进行改进，使其更适合于抗革兰氏阴性菌。