[发明专利]一种提高茄子病毒诱导基因沉默效率的方法

说明书

本发明公开了一种提高茄子病毒诱导基因沉默效率的方法，属于植物基因工程技术领域。本发明综合考虑了影响茄子VIGS沉默效率的多方面因素，通过构建含有目的基因片段的TRV2病毒沉默重组载体，采用真空渗透的方法侵染萌芽期种子，诱导内源目的基因发生沉默。该方法处理的沉默植株表型出现速度快、效率高，表型变化持续时间长，且克服了注射接种对植株伤害和茄子子叶较小注射接种困难等问题，为快速验证基因功能提供了有效的方法。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高茄子病毒诱导基因沉默效率的方法。

背景技术

病毒诱导的基因沉默(Virus-induced Gene Silencing,VIGS)是利用植物对RNA病毒防御机 制发展的技术,是通过携带一段目的基因片段的病毒载体侵染植株引发寄主中序列同源基因 的沉默，从而实现对基因功能的鉴定(Senthil-Kumar&Mysore,2011)。VIGS技术与传统地转基 因、基因敲除、反义抑制等基因功能研究方法相比，不需要植物的遗传转化或获取突变体， 能简单、快速、瞬时、高效、特异地鉴定基因功能，已成为植物基因功能研究中的有效技术 方法。随着VIGS技术研究地不断发展，该技术已经广泛的应用在不同植物抗性、生长发育 以及代谢调控等相关功能基因的研究鉴定，在植物性状改良和植物保护等方面具有良好的发 展及应用前景。

目前茄子全基因组草图已完成，产生大量DNA序列信息，大量未知基因有待发掘与鉴 定。传统的基因功能研究手段需要有成熟的遗传转化体系，但茄子的转化效率较低，且对受 体基因型的依赖性较强，严重限制茄子功能基因组研究的发展。随着VIGS技术地发展，目 前已成功运用在茄子抗病、果实发育等基因功能研究中。尽管VIGS技术具有较多地优越性， 但还存在一定的局限性，如该技术很少能够完全沉默或抑制靶基因的表达，不同插入片段大 小、接种方法、培养环境等都对基因沉默效率影响较大。特别是目前茄子VIGS技术接种病 毒的方式多为注射压迫渗透叶片接种，对茄苗损害较大，沉默效率较低，接种病毒时所需农 杆菌侵染液制备量大，接种过程耗时长等缺点，而且不利于研究发育早期的基因功能。因此 针对茄子VIGS技术中的不足之处进行改良，并对不同处理沉默效率的评价，提供一种高效、 快捷的茄子，促使该技术在茄子基因功能研究中发挥更大作用。

发明内容

技术问题

本发明针对茄子VIGS技术中的不足之处进行改良，提供高效、快速、便捷茄子病毒诱 导基因沉默的方法。利用本发明所述的方法可获得病毒诱导茄子内源基因最佳沉默体系。

技术方案

具体包括如下步骤：

一种提高茄子病毒诱导基因沉默效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)茄子病毒基因重组表达载体的构建；

(2)适宜侵染萌芽期种子制备：利用1‰赤霉素浸种12h后，28℃催芽直到种子露白后 2～3d，芽长0.5～1cm时备用；

(3)侵染液的制备

(4)侵染液接种：利用真空渗透方法侵染接种萌芽期种子：真空侵染系统由真空干燥器 和便携式真空泵组成，抽真空渗透压强为-25kpa，抽气时间为2min；

(5)接种后培养：接种后先放入20℃人工气候箱中暗培养至破土后再转入正常培养，培 养环境为25℃条件下光照16h，20℃条件下黑暗8h，相对湿度在50％～60％；

(6)诱导茄子病毒基因沉默的表型观察与检测。