[发明专利]辐抗肽突变蛋白及其制备与纯化方法

说明书

本发明公开了一种辐抗肽或其突变蛋白的制备和纯化方法，该方法可显著提高蛋白的纯度，便于工业化生产。本发明还提供了一种辐抗肽突变蛋白，该突变蛋白是在辐抗肽蛋白CBLB502的基础上，将ND1和CD1结构域之间的氨基酸序列进行替换，所述突变蛋白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，其稳定性显著优于现有技术中的CBLB502蛋白。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及辐抗肽蛋白CBLB502或其突变蛋白的表达、分离和纯化的制备方法，并涉及由上述方法所得的辐抗肽突变蛋白。

背景技术

Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)是Lemaitre等人在1996年研究果蝇过程中发现，目前研究表明，在人体内发现了11个TLRs家族成员，主要表达于免疫细胞等。Toll-like receptors(TLRs)家族是一类在机体固有免疫和获得性免疫应答中发挥重要作用的模式识别受体，它们通过特异性识别细菌、病毒等病原体相关分子模式活化NF-κB信号通路介导炎症反应、抗病毒反应和免疫效应细胞的分化成熟，并以此抵御病原微生物的入侵(Kumar H,et al.Toll-like receptors and innate immunity.BBRC,2009,388:621-625)。

TLR5作为TLRs家族中一员，其唯一配体为细菌的鞭毛蛋白。近期研究表明，细菌鞭毛蛋白或者其保留TLR5结合活性的衍生物(如CBLB502，其含有鞭毛蛋白主要功能结构域的重组蛋白，我们称之为辐抗肽)对γ射线照射后导致的辐射损伤具有保护作用，其抗辐射作用机制是通过结合细胞表面TLR5，激活细胞内的NF-kB信号通路，抑制辐射照射引起的细胞凋亡，进而达到降低辐射损伤的效果(Burdelya LG,et al.An agonist of toll-likereceptor 5has radioprotective activity in mouse and primate models.Science,2008,320:226-230)。此外，还有研究报道表明辐抗肽对肝损伤具有保护作用。

有研究发现TLR5(Toll Like Receptor 5)受体的特异性配体-沙门氏菌鞭毛蛋白及功能同源衍生物CBLB502(含有鞭毛蛋白主要功能结构域的重组蛋白，我们称之为辐抗肽)可以和细胞表面的TLR5结合并激活NF-kB信号通路，在不引发急性炎症反应的情况下，减轻射线引起的肠道上皮细胞、血管内皮细胞和造血细胞凋亡，保护细胞免受辐射损伤并促进组织再生，而并没有降低肿瘤的辐射敏感性(Burdelya LG,et al.An agonist oftoll-like receptor 5has radioprotective activity in mouse and primatemodels.Science,2008,320:226-230)

辐抗肽蛋白来源于沙门氏菌鞭毛蛋白，编码296个氨基酸，分子量约为31KD。在大肠杆菌表达系统中，重组的辐抗肽蛋白趋向于形成包涵体，而且同野生型Fli C蛋白相比，辐抗肽在纯化和储存过程中更容易发生降解。有文献研究表明，这可能与辐抗肽蛋白本身的分子结构设计存在缺陷有关(Song WS,Jeon YJ,Namgung B,et al.A comservedTLR5binding and activation hot spot on flagellin.Scientific Reports.2017,7:40878.)。辐抗肽蛋白在其ND1和CD1结构域之间插入了人为设计的链接序列并保留了部分CD2结构域的部分氨基酸序列，这种分子结构没有充分考虑到鞭毛蛋白蛋白结构的完整性和蛋白折叠特性。改进的办法是将这一部分用类似枯草芽孢杆菌杆菌的环状结构的氨基酸序列将其替换，以增加辐抗肽蛋白的稳定性。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种辐抗肽或其突变蛋白的制备与纯化方法，不同于常规的苯基疏水层析，本发明采用丁基疏水层析方法进行纯化，该纯化方法可显著提高蛋白的纯度。