[发明专利]一种卵巢组织的冻存与复苏方法

权利要求书

1.一种卵巢组织的冻存与复苏方法，其特征在于，包括冻存方法，所述的冻存方法包括以下步骤：

（1）预处理：将卵巢组织置于转移液中，去除髓质，保留皮质并切为组织片；

（2）渗透平衡：将组织片转移到盛有冻存保护液的样本盒内，置于冰中平衡；

（3）冻存：冻存管中加入一定量的冻存保护液，组织块放入冻存管中，然后逐步降温进行液氮冻存；

冻存方法中，所述的逐步降温进行液氮冻存的过程包括：

（1）2℃平衡，维持15min；（2）以6℃/min的速度降至-2℃；（3）以4℃/min的速度降至-4℃；（4）以2℃/min的速度降至-7.5℃；（5）以0.5℃/min的速度降至-8℃；（6）以0.5℃/min的速度降至-11.5℃；（7）以0.1℃/min的速度降至-13℃；（8）以0.3℃/min的速度降至-42℃；（9）以50℃/min的速度降至-100℃；逐步降温进行液氮冻存的过程中，温度降至-8℃时达到植冰点，此时蘸取液氮置于冻存管壁的液面处，结晶启动；

冻存方法中，所述的冻存保护液包括Leibovitz L-15培养基，8-10 V/V%DMSO以及0.5-1.0 V/V%HSA或8-10 V/V% SSS，5mM的氮乙酰半胱氨酸；

还包括复苏方法，所述的复苏方法包括以下步骤：

（1）将装有卵巢组织的冻存管从液氮中取出，溶解；

（2）将卵巢组织从冻存管中取出，依次加入复苏液1、复苏液2、复苏液3的溶液中分别保持一定时间，再放入洗脱液中洗脱，完成复苏；

所述的复苏液1、复苏液2、复苏液3分别为：

（1）复苏液1：90V/V%DPBS，10V/V%HSA，0.5-0.8mol/L蔗糖，5mM氮乙酰半胱氨酸；

（2）复苏液2：90V/V%DPBS，10V/V%HSA，0.3-0.5mol/L蔗糖，5mM氮乙酰半胱氨酸；

（3）复苏液3：90V/V%DPBS，10V/V%HSA，0.12-0.3mol/L蔗糖，5mM氮乙酰半胱氨酸。

2.根据权利要求1所述的一种卵巢组织的冻存与复苏方法，其特征在于，所述的冻存保护液还包括牛磺酸和维生素E中的至少一种，其中，牛磺酸的含量为0.5-5mM，维生素E的含量为0.1-10mM。

3.根据权利要求2所述的一种卵巢组织的冻存与复苏方法，其特征在于，牛磺酸的含量为5mM，维生素E的含量为3-5mM。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的一种卵巢组织的冻存与复苏方法，其特征在于，复苏液1、复苏液2和复苏液3中还包括牛磺酸和维生素E中的至少一种；所述的牛磺酸的含量为0.5-5mM；维生素E的含量为0.1-10mM。

5.根据权利要求4所述的一种卵巢组织的冻存与复苏方法，其特征在于，维生素E的含量为3-7mM。

6.根据权利要求5所述的一种卵巢组织的冻存与复苏方法，其特征在于，维生素E的含量为5mM。

7.根据权利要求1-3任意一项所述的一种卵巢组织的冻存与复苏方法，其特征在于，所述的洗脱液包括90V/V%DPBS，10V/V%HSA；从复苏液3中取出的卵巢组织在洗脱液中清洗两次，依次在洗脱液中分别保持10min和5min。

8.根据权利要求7所述的一种卵巢组织的冻存与复苏方法，其特征在于，洗脱液还包括牛磺酸、氮乙酰半胱氨酸、维生素E中的至少一种；所述的牛磺酸的含量为0.5-5mM；所述的氮乙酰半胱氨酸的含量为0.5-5mM；维生素E的含量为0.1-10mM。