[发明专利]一种夹心型肺癌标志物电化学传感器的制备方法及应用

权利要求书

1.一种夹心型肺癌标志物电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

（2）取6 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的聚多巴胺功能化的金纳米粒子分散液滴涂到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；

（3）将6 µL、8 ~ 12 µg/mL的肺癌标志物捕获抗体Ab₁滴加到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中干燥；

（4）继续将3 µL、0.5 ~ 1.5 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

（5）滴加6 µL、0.0001 ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的肺癌标志物抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

（6）将6 µL、1.5 ~ 3.5 mg/mL检测抗体孵化物Au@Pt DNs/NG/Cu²⁺-Ab₂溶液滴至电极表面，置于4 ℃冰箱中孵化40 min，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干，制得一种夹心型肺癌标志物电化学传感器；

所述聚多巴胺功能化的金纳米粒子的制备，步骤如下：

（1）金纳米粒子溶液的制备

将1 ~ 2 mL、质量分数为1%的氯金酸加入99 mL超纯水中，加热至沸腾后加入1.5 ~3.5 mL、质量分数为1%的柠檬酸钠溶液，回流10 ~ 30 min，冷却至室温，得到酒红色的金纳米粒子溶液；

（2）聚多巴胺功能化的金纳米粒子的制备

取10 ~ 20 mg多巴胺加入到10 mL、10 mmol/L的pH = 8.5的Tris-HCl缓冲液中，加入10 mL上述制备的金纳米粒子溶液，在室温下振荡24h，得到聚多巴胺功能化的金纳米粒子；

所述Au@Pt DNs/NG/Cu²⁺的制备，步骤如下：

（1）Au@Pt DNs的制备

在烧瓶中配制10 mL含0.25 mmol/L氯金酸和75 mmol/L十六烷基三甲基溴化铵的水溶液，剧烈搅拌下快速加入0.6 mL、10 mmol/L硼氢化钠，室温下缓慢搅拌3h后制得金水溶胶；量取1 mL制得的金水溶胶超纯水稀释至100 mL，制得金晶种溶液；

将0.1~0.5 mL、10 mmol/L氯金酸，2~3 mL、0.2 mol/L十六烷基三甲基溴化铵和1.5~2.0mL、0.1 mol/L抗坏血酸的水溶液混合，在混合液中加入0.3 ~ 0.5 mL金晶种溶液，超纯水稀释至25mL，在室温下振荡8h，制得立方金纳米粒子的溶液；在立方金纳米粒子的溶液中依次加入1 ~ 3 mL、0.1 mol/L抗坏血酸和1 mL、10 mmol/L氯亚铂酸钾，于60 ℃的水浴中反应12h，离心，超纯水洗涤3次，于40 ℃真空干燥箱中烘干，制得Au@Pt DNs；称取一定质量的Au@Pt DNs超声分散到一定体积的超纯水中制成Au@Pt DNs分散液使用；

（2）氮掺杂石墨烯NG的制备

称取20 ~ 40 mg丙醛肟置于500 mL三口烧瓶中，依次加入200 mL浓氨水和15 mL氧化石墨烯悬浮液，超声分散均匀后，将三口烧瓶转移到油浴锅中，在搅拌条件下90 ℃反应4h，自然冷却至室温，离心分离，用超纯水洗涤至滤液成中性，冻干，制得NG；

所述氧化石墨烯悬浊液制备方法如下：称取2.0 g石墨粉，加入96 mL浓硫酸，在搅拌条件下反应20 min，随后加入12 g高锰酸钾，在冰水浴条件下搅拌1.5h，随后加热至55℃，反应5h；缓慢加入100 mL超纯水后，再加入10 mL、质量分数30%的双氧水，搅拌30 min，离心分离，上清液即为氧化石墨烯悬浮液；

（3）Au@Pt DNs/NG/Cu²⁺的制备

称取10 mg上述制备的NG，分散在10 ~ 20 mL、1 mg/mL的Au@Pt DNs分散液中，超声2h，离心分离，40 ℃下烘干得到Au@Pt DNs/NG；取10 mg的Au@Pt DNs/NG分散在10 mL超纯水中，加入1 ~ 3 mmol/L氯化铜，在室温下搅拌24h，离心分离，40 ℃下烘干，制得Au@Pt DNs/NG/Cu²⁺；

（4）Au@Pt DNs/NG/Cu²⁺-Ab₂的制备

称取3 ~ 7 mg的Au@Pt DNs/NG/Cu²⁺分散到1 mL超纯水中，加入100 µL、80 ~ 120 µg/mL的检测抗体孵化物Au@Pt DNs/NG/Cu²⁺-Ab₂溶液和900 µL、50 mmol/L的pH = 6.8的磷酸盐缓冲溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12h，离心分离，重新分散于1 mL、50 mmol/L的pH = 6.8的磷酸盐缓冲溶液，制得Au@Pt DNs/NG/Cu²⁺检测抗体Ab₂孵化物溶液，4 ℃下保存备用。