[发明专利]一种从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法

说明书

本发明提供一种从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法，具体过程如下：获取动物小肠，经清洗、剪碎后置于离心管中，加入上皮剥离液搅拌剥离；移除上清液，加入中和液1，搅拌；移除上清液，加入中和液2，静置分离；移除上清液，加入消化酶混合液，搅拌消化；加入HBSS离心，移除上清后，用HBSS重悬后过滤；所得滤液离心后用Percoll液重悬后移至底部铺有Percoll液的离心管；离心，中间层细胞收集，离心，收集沉淀；用稀释后抗体混悬所得的细胞团，离心，收集沉淀；用流式缓冲液重悬沉淀，上机流式细胞仪得到ILC。该方法从小鼠肠粘膜中分离并纯化出固有淋巴细胞，获取细胞数量多、活率高、纯度高，为肠道黏膜免疫的研究奠定研究基础。

技术领域

本发明属于细胞分离纯化技术领域，具体涉及一种从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法。

背景技术

近年来，随着免疫活性细胞分离方法的进步，肠道黏膜免疫得到越来越多的免疫科学工作者的重视，肠道黏膜免疫的研究已成为免疫学研究热点之一。肠道黏膜免疫系统是潜在病原体、食品以及共生菌的共同入口。肠道黏膜免疫系统长期暴露于复杂的环境中，因此能够对食品和共生菌的刺激产生耐受，同时对病原体的刺激产生免疫反应。肠黏膜主要由上皮层、固有层及浆膜层构成，含有种类丰富、数目繁多的免疫细胞，是哺乳动物识别、捕获经消化道进入体内的外界病原微生物的重要场所，其功能与感染、肿瘤等多种疾病密切相关。固有淋巴细胞（ILC，Innate Lymphoid Cell）是新近发现的一类新型非T非B淋巴细胞。ILC具备固有免疫细胞（又称先天性免疫细胞）的基本特征，却同时能够分泌细胞因子参与获得性免疫应答（又称后天性免疫应答）。近年针对ILC的研究逐渐兴起，有助于提升抗感染、抗肿瘤等临床诊疗水平。对肠黏膜中原代ILC进行分离纯化是开展此类研究的关键前提条件。

目前多从肺、脾等实质脏器或外周血中提取ILC，尚缺少自小肠、结肠等空腔脏器中提取ILC的方法。肠黏膜中存在种类繁多的细胞类型（如上皮细胞、T/B淋巴细胞、单核/树突状细胞、成纤维细胞、中性粒细胞等），分离提取过程中其他细胞导致的背景干扰较大；另外，ILC数目较少、比例较低（<1%），造成从肠黏膜中提取ILC比从实质脏器或血液中提取ILC更难，且当前从实质脏器或血液中提取ILC的方法无法用于肠。

因此，需要提供一种能简化、高效、稳定的肠道分离ILC的方法，为其相关研究奠定基础。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法，该方法简单、高效、稳定，分离的ILC的纯度高，适用于后续研究。

为解决上述问题，本发明提供一种从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法，具体过程如下：

1）获取动物小肠，经清洗、剪碎后置于离心管中，加入上皮剥离液搅拌剥离；

2）移除上清液，加入中和液1，搅拌；

3）移除上清液，加入中和液2，静置分离；

4） 移除上清液，加入消化酶混合液，搅拌消化；

5） 加入HBSS离心，移除上清后，用HBSS重悬后过滤；

6）步骤5）所得滤液离心后用第一Percoll液重悬后移至底部铺有第二Percoll液的离心管；

7） 离心，取中间层细胞收集，再次离心，收集沉淀；

8）用稀释后抗体混悬步骤7）所得的细胞团，离心，收集沉淀；

9） 用流式缓冲液重悬沉淀，上机流式细胞仪得到ILC。