[发明专利]一种从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法

权利要求书

1.一种从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法，其特征在于，具体过程如下：

1）获取动物小肠，经清洗、剪碎后置于离心管中，加入上皮剥离液搅拌剥离；

2）移除上清液，加入中和液1，搅拌；

3）移除上清液，加入中和液2，静置分离；

4）移除上清液，加入消化酶混合液，搅拌消化；

5）加入HBSS离心，移除上清后，用HBSS重悬后过滤；

6）步骤5）所得滤液离心后用第一Percoll液重悬后移至底部铺有第二Percoll液的离心管；

7）离心，取中间层细胞收集，再次离心，收集沉淀；

8）用稀释后抗体混悬第7）所得的细胞团，离心，收集沉淀；

9）用流式缓冲液重悬沉淀，上机流式细胞仪得到ILC。

2.根据权利要求1所述的从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法，其特征在于，步骤1）获取动物小肠后放入HBSS液中，移除肠系膜及其脂肪、Peyer氏结；纵行剖开肠壁，用PBS液清洗，将肠管剪碎后置于4℃ PBS液中暂存。

3.根据权利要求2所述的从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法，其特征在于，所述加入上皮剥离液搅拌剥离的具体过程如下：加入37℃的上皮剥离液、磁力搅拌珠，将离心管倒置于磁力搅拌仪表面，在37℃ 5% CO₂培养箱内，以400 rpm磁力搅拌30分钟；

所述上皮剥离液为HBSS + EDTA + DTT + HEPES + FBS的混合溶液，其中EDTA终浓度5mM、DTT终浓度1mM、HEPES终浓度25mM、FBS终浓度5%。

4.根据权利要求1所述的从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法，其特征在于，所述中和液1为RPMI + EDTA + FBS的混合溶液，其中EDTA终浓度1mM、FBS终浓度10%；

所述步骤2）中搅拌的具体过程为：将步骤2）的离心管倒置放于磁力搅拌仪表面，于37℃ 5% CO₂培养箱内，以200rpm磁力搅拌15分钟。

5.根据权利要求1所述的从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法，其特征在于，所述中和液2为RPMI + HEPES + FBS的混合溶液，其中HEPES终浓度25mM、FBS终浓度10%；

所述步骤3）中静置分离的时间为10分钟。

6.根据权利要求1所述的从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法，其特征在于，所述消化酶混合液为：HBSS + Liberase TL + DNase I + 胶原酶IV + FBS的混合溶液，其中Liberase TL终浓度0.167mg/ml、DNase I终浓度200U/ml、胶原酶IV终浓度100U/ml、FBS终浓度5%；

所述步骤4）中搅拌消化的具体过程为：将步骤3）的离心管加入消化酶混合液后倒置放于磁力搅拌仪表面，置于37℃ 5% CO₂培养箱内，以200rpm磁力搅拌45分钟。

7.根据权利要求1所述的从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法，其特征在于，所述步骤5）中过滤是指用100um滤网过滤；

所述步骤6）中第一Percoll液为44%的Percoll液，所述第二Percoll液为67%的Percoll液。

8.根据权利要求1所述的从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法，其特征在于，所述步骤7)中离心是指20℃ 600g离心20分钟；所述再次离心是指500g室温离心5分钟。

9.根据权利要求1所述的从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法，其特征在于，所述稀释后抗体是指含990ul流式缓冲液与10ul抗体原液，稀释比为1:100。

10.根据权利要求9所述的从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法，其特征在于，

所述步骤8）中离心是指在室温下离心3000rpm、3分钟；

所述抗体为DAPI、LIN、CD3、CD45、CD90.2或其组合；所述LIN为CD11c、CD19、CD45R/B220、Ly6G/Ly6C、CD11b、FcεRI α、NK1.1或其组合；

所述流式缓冲液为PBS + FBS的混合溶液，其中FBS终浓度5%；

所述流式细胞仪设置为DAPI- LIN- CD3- CD45+ CD90.2+。