[发明专利]一种微腔式多色荧光数字PCR芯片及应用

说明书

本发明涉及一种微腔式多色荧光数字PCR芯片及应用，包括进液口、双侧微腔阵列和双侧废液仓。所述芯片用于微量癌症稀有突变分析、差异基因表达分析或高精度拷贝数变异分析。本发明使用多色荧光检测，可大幅提高单个芯片的检测通量，极大提高反应效率，操作方便，速度快，能够达到极高的检测灵敏度，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于液体活检领域，特别涉及一种微腔式多色荧光数字PCR芯片及应用。

背景技术

近年来，随着居民生活方式的改变以及环境污染等因素，恶性肿瘤已成为居民健康的最大杀手。在2012年，大约有1,410万人罹患癌症，并且造成820万人身亡(相当于全年总死亡人数的14.6％)。由于癌症的发病原因及发病机制极为复杂，且临床表现具有个体差异，多数患者就诊时已发展至晚期。临床统计数据显示，以肺癌为例，其总体5年生存率仅为10％-16％，而其中I期患者的5年生存率可达65-75％。因此，早发现、早治疗对延长癌症患者生存期有积极作用。但随着对肿瘤研究的深入，科学家发现在癌症的诊断和治疗过程中组织活检技术有一定的局限性。液体活检(Liquid Biopsy)作为一种新的检测手段，可以较容易的，反复、多次获取患者的体液作为检测样品，从而可代替传统的检查方法。其优势在于能通过非侵入性取样降低活检的危害，而且有效延长患者生存期，性价比较高。目前液体活检的主要检测物包括检测血液中游离的循环肿瘤细胞(CTCs)，循环肿瘤DNA(ctDNA)碎片，循环RNA(Circulating RNA)和外泌体(携带有细胞来源相关的多种蛋白质，脂类，DNA，RNA等)。目前编码蛋白基因中的致癌性突变检测已被作为个体化诊疗的标志物，而新近研究发现，非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)在癌症中扮演着很重要的角色，ncRNA表达水平上的差异或某些癌症类型特异性ncRNA的表达，可作为肿瘤诊断和治疗的新的分子标志物。因此，针对循环肿瘤相关ncRNA表达与功能的研究，将为癌症的诊断、治疗及预后提供新的策略。

数字PCR(digital PCR，dPCR)技术是一种新的核酸检测和定量方法，与传统定量PCR(qPCR)技术不同，数字PCR采用绝对定量的方式，不依赖于标准曲线和参照样品，直接检测目标序列的拷贝数。数字PCR采用“分而治之”(Divide and Conquer)的策略，将一个标准PCR反应分配到成千上万个纳升或皮升级的微反应器中，每个反应器作为一个独立的扩增体系，绝大多数微腔中仅包含一个或零个目标分子的拷贝，从而实现了“单分子模板PCR扩增”，扩增结束后，通过阳性微反应器的数目“数出”目标序列的拷贝数。在实际的数字PCR实验中，是通过呈现两种信号类型“有和无”来体现微反应器的比例和数目进行统计学分析，计算出原始样品中的模板拷贝数。

基于众多的优势，数字PCR技术也引起了科学界及商业界的追捧。目前基于微流控技术的数字PCR系统主要有两种，基于微腔的cdPCR技术(chamber-based dPCR)和基于液滴的ddPCR技术(droplet-based dPCR)，比较典型的并且已经得到实际应用的包括Bio-Rad公司推出QX200Droplet Digital PCR系统、Raindance公司推出RainDrop Digital PCR系统和Life公司推出的QuantStudio 3D Digital PCR系统等。然而目前的数字PCR系统主要存在以下不足：系统的集成度较低。QX200、Raindrop、QuantStudio系统均需要使用两到三台不同的仪器分别完成数字PCR的样品分散、扩增以及检测等步骤，操作繁琐，仪器设备昂贵。样品在这些仪器中的转移和切换过程中，存在污染风险，导致假阳性信号的出现。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种微腔式多色荧光数字PCR芯片及应用，该芯片使用多色荧光检测，可大幅提高单个芯片的检测通量，极大提高反应效率，操作方便，速度快，能够达到极高的检测灵敏度，具有良好的应用前景。