[发明专利]一种定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的荧光微球检测卡

说明书

本发明涉及一种定量检测牛奶中β‑内酰胺酶残留的荧光微球检测卡及其制备方法，具体步骤为：（1）抗β‑内酰胺酶配对单克隆抗体的制备，包括免疫程序、细胞融合、杂交瘤筛选及克隆化、抗体制备及纯化；（2）β‑内酰胺酶残留的荧光微球定量检测检测卡及其制备方法，包括荧光微球抗β‑内酰胺酶单克隆抗体的制备、微球垫处理、喷膜、C，T线确定、性能测定。本发明检测牛奶中β‑内酰胺酶残留的最低检测限为1×10^‑6U/mL(U/g)，并且牛奶样本直接检测，无需任何样本处理过程，可以快速、灵敏、准确的定量检测牛奶中β‑内酰胺酶残留。

技术领域

本发明属于生物技术领域以及食品安全定量检测技术领域，具体涉及一种半定量快速定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的荧光微球定量检测检测卡及其制备方法。

背景技术

β-内酰胺酶（β-lactamase）是细菌产生的可水解β-内酰胺环抗生素的酶。β-内酰胺酶的产生是细菌对(β-内酰胺类)抗菌药物耐药最常见的机制，广泛地涉及到许多社区获得性感染和医院内感染的重要病原菌，在各种耐药机制中占80%。β-内酰胺酶因可以分解牛奶中残留的β-内酰胺类抗生素，掩盖抗生素痕迹，故被列入《食品中可能违法添加的非食用物质》名单，中国不允许在牛奶中添加。

目前，定量检测牛奶中β-内酰胺酶的方法，包括微生物法、碘量法、头孢菌素显色法、酸度法和高效液相色谱法。液相色谱-串联质谱(RRLC-MS/MS)定量检测方法利用活性β-内酰胺酶能够酶解青霉素族药物的特性，在原乳中加入适量氨苄青霉素，酶解1h后，定量检测原乳中氨苄青霉素酶解率，定性定量检测活性目标物。试样中氨苄青霉素经乙腈溶液提取，HLB固相萃取柱净化和浓缩后，RRLC-MS/MS多反应监测模式定性与定量分析，该方法对活性β-内酰胺酶检出限为4U/mL。牛奶中β-内酰胺酶残留的检测方法改进有Charm试剂盒，结果显示，β-内酰胺酶在快速检测法中的最低检出限为1.5×10^-4～1.6×10^-3U/mL(U/mL)。发明专利申请CN201310001684.2公开了一种检测牛奶中β-内酰胺酶的双抗体夹心法，应用重组β-内酰胺酶免疫8周龄的BALB/c小鼠，经过正常的免疫、细胞融合、筛选后得到15株β-内酰胺酶单克隆抗体，15株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶（HRP）并进行两两配对，以JN2011-03、JN2011-04分别为包被抗体和酶标抗体，以β-内酰胺酶为标准品建立了β-内酰胺酶的夹心ELISA分析方法，LOD为1.22ng/mL，线性范围为10-100ng/mL。发明专利CN201310293739.1公开了一种定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的试剂盒，包含包被有青霉素结合蛋白的酶标板、标记物偶联β-内酰胺类抗生素、底物对照1为β-内酰胺类抗生素浓度为0ppb的脱脂奶粉冻干品、底物对照2为含标定浓度β-内酰胺类抗生素的脱脂奶粉冻干品、β-内酰胺类抗生素标准品，所述试剂盒具有良好的特异性和灵敏性，可检出大约0.5U/ml浓度的β-内酰胺酶，线性检出范围为1U/ml～16U/ml。发明专利申请CN201110162413.6公开了一种用于检测原料乳及乳制品中β-内酰胺酶的检测装置及其检测方法，包括检测试纸条、标准比色卡；标准比色卡由9个色块组成，从浅到深分别对应于0U/mL、6U/mL、12U/mL、25U/mL、50U/mL、100U/mL、150U/mL、200U/mL、250U/mL的β-内酰胺酶浓度；检测试纸条由过滤层、显色层、吸水材料层和基板组成，以2,2'-联喹啉乙醇溶液作为显色剂和CuSO₄作为络合剂制备而成，根据待测样品显色程度与标准比色卡的对比，快速判定β-内酰胺酶的含量范围。

以上定量检测方式均存在检测时间长，有的需要大型仪器辅助测试，检测费用高等缺点。本研究利用免疫微球定量检测原理，研制出一种新型的快速定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的荧光微球检测卡及其制备方法，为快速、灵敏、准确的定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留减少了时间和成本。

发明内容

本发明提供了一种定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留的检测卡及其制备方法，本发明为快速、灵敏、准确的定量检测牛奶中β-内酰胺酶残留减少了时间和成本，并提升了灵敏度。