[发明专利]一种用于预防HPV感染的核酸疫苗

说明书

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种HPV L1微环DNA疫苗及其在预防HPV感染的应用。本发明的HPV L1微环DNA中包含HPV16亚型的L1(主要衣壳蛋白)的核苷酸序列。同时，本发明采用的微环DNA具有以下优点：1)不整合入宿主细胞基因组，不会诱发新的突变，较病毒载体更为安全；2)可在工程细菌内大量扩增，制备工艺简单，产业化生产成本低；3)表达外源基因较传统质粒稳定，高效。本发明的HPV L1微环DNA用于制备疫苗对于宫颈癌的预防有重要意义。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种HPV L1微环DNA疫苗及其制备方法，以及在预防HPV感染的应用。

背景技术

宫颈癌占女性妇科恶性肿瘤的第二位，现已成为威胁女性健康的重要疾患，中国每年死于宫颈癌的人数将近5万，宫颈癌的病因研究一直为国内外学者所重视，研究发现引起宫颈癌的关键是HPV的感染。HPV属于乳头瘤病毒科乳头瘤病毒属，是球形、双链环状DNA病毒。HPV主要通过直接或间接接触污染物品或通过性传播感染人类。HPV的感染有宿主特异性和组织特异性，只能感染人类的皮肤和粘膜受损的基底细胞。

HPV至今已鉴定明确的大约有200多个亚型，根据其致病和预后不同又可分为高危型HPV(HR-HPV)和低危型HPV(LR-HPV)，其中HR-HPV 15种，包括HR-HPV16、18、31、33、35、39、45、5l、52、56、53、58型等，感染后可引起癌前病变和宫颈癌。其中HPV16和HPV18是最主要的流行株。HPV 16型和HPV 18型可导致约70％的宫颈癌病例、80％的肛门癌、60％的阴道肿瘤和40％的外阴癌。只有持续的HR-HPV的感染才是宫颈癌的主要因素。

HPV L1衣壳蛋白是人乳头瘤病毒的主要结构蛋白,是病毒感染细胞和细胞免疫反应攻击病毒的主要靶位，且该蛋白较为保守。因此可以针对L1蛋白开发预防/治疗宫颈癌的药物。

DNA疫苗，是将外源目的基因构建于真核表达载体，可直接注射到动物体内的第三代疫苗。其使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答。

基因载体的选择对DNA疫苗的构建至关重要，一方面，标准质粒的骨架DNA成分均包括DNA复制起始位点、抗性基因、转录终止子等，某些成分会抑制目的基因表达，并且载体基因DNA可能插入宿主基因组，诱发插入突变和基因沉默的危险；另一方面，标准质粒转导效率低，目的基因只能实现瞬间表达，其分子量较大，容易引发免疫反应和被机体所清除。因此，安全高效的表达是研究核酸DNA疫苗基因治疗的关键。

近年开发的微环DNA载体(MC)技术有助于解决以上问题。微环DNA是亲本质粒(parentalplasmid，PP)体内位点特异性重组的产物。在携带真核表达框的亲本质粒两侧插入重组酶识别位点，诱导体内相关重组酶表达，该重组酶将识别位点中间的DNA序列切断，亲本质粒被分成2个超螺旋分子，即具有复制功能的小质粒(miniplasmid，MP)和携带真核表达框的微环(minicircle，MC)DNA。

微环DNA是传统质粒在大肠杆菌中通过位点特异性重组得到的一种新颖的小环超螺旋表达框，其缺乏抗性标记基因、复制原点等细菌序列，增强了在临床应用上的安全性，可在体内长期表达高水平的转基因产物。MC在结构、转基因表达的持久性、细胞内的稳定性上，与共价键密闭环状DNA(cccDNA)相同，使MC成为安全、高效的理想载体。

与传统质粒和病毒载体比较，微环DNA在哺乳动物细胞内表达外源基因具有一系列独特的优势：1)不整合入宿主细胞基因组，不会诱发新的突变，较病毒载体更为安全；2)可在工程细菌内大量扩增，制备工艺简单，产业化生产成本低；3)去除了传统质粒中的抑制信号，表达外源基因较传统质粒稳定，高效。

目前预防性疫苗Gardasil/Cervarix可有效预防HPV感染，其属于蛋白疫苗，成本较高，故有必要开发预防HPV感染的核酸疫苗。尚无针对HPV L1壳蛋白的预防宫颈癌的微环DNA疫苗。