[发明专利]一种以胞外高分子聚合物包埋缓释磷肥的实验方法

权利要求书

1.一种以胞外高分子聚合物包埋缓释磷肥的实验方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)选取材料：

a.供试菌株

解磷菌菌株PMKN150713，筛选自金银花茎下端，经研磨、离心并用无N、PKO和孟金娜固体培养基筛选而得；

b.培养基

b1.筛选培养基:

1)无N固体培养基：磷酸氢二钾50gL^-1、母液5mLL^-1、氯化钠25gL^-1、甘露醇10gL^-1、琼脂15gL^-1、蒸馏水1L，PH7±0.5，121℃湿热灭菌26min制成固体平板；母液的制备：磷酸二氢钾50gL^-1、2水合钼酸钠1gL^-1、7水硫酸镁25gL^-1、4水硫酸锰1gL^-1、氯化钠25gL^-1、7水硫酸铁1gL^-1；

2)PKO固体培养基：葡萄糖10gL^-1、磷酸钙5gL^-1、硫酸铵0.5gL^-1、氯化钠0.2gL^-1、氯化钾0.2gL^-1、7水硫酸镁0.3gL^-1、硫酸锰0.03gL^-1、硫酸亚铁0.003gL^-1、酵母粉0.5gL^-1、琼脂粉18gL^-1、蒸馏水1L，磷酸钙5gL^-1过筛后灭菌与培养基混合，pH 7.0±0.2，121℃湿热灭菌26min制成平板；

3)蒙金娜固体培养基：葡萄糖10gL^-1、卵磷脂0.2gL^-1、硫酸铵0.5gL^-1、氯化钠0.3gL^-1、氯化钾0.3gL^-1、碳酸钙5gL^-1、4水硫酸锰0.03gL^-1、7水硫酸亚铁0.03gL^-1、酵母膏0.4gL^-1、琼脂粉20gL^-1、蒸馏水1L，pH 7.0±0.2，121℃湿热灭菌26min制成平板；

b2.发酵培养基:

1)YEM液/固体培养基：磷酸氢二钾0.5gL^-1、硫酸镁0.2gL^-1、氯化钠0.1gL^-1、甘露醇10gL^-1、酵母粉1gL^-1、蒸馏水1L、琼脂粉15gL^-1，PH7±0.2，121℃湿热灭菌26min制成液/固体培养基；

2)CSE液体培养基：秸秆粉10gL^-1，400ml80℃温水浸提10min，用双层滤纸过滤，取全部滤液定容至500ml，121℃湿热灭菌26min；制成液得到1：50的CSE原液灭菌后避光保存备用，使用时需稀释一倍，PH7±0.2；

3)察氏液体培养基：硝酸钾3gL^-1、磷酸氢二钾1gL^-1、七水硫酸镁0.5gL^-1、氯化钠0.5gL^-1、硫酸亚铁0.01gL^-1、蔗糖30gL^-1、蒸馏水1L，PH7±0.2，121℃湿热灭菌26min制成液体培养基；

C.供试碳源、氮源

碳源：蔗糖、葡萄糖、甘露醇和丁二酸；氮源：蛋白胨、酵母粉、硝酸钾、硫酸铵和磷酸铵；

d.速溶性磷肥：磷酸二氢铵

(2)制备EPS，摇瓶发酵，将菌株PMKN150713转接于YEM、CSE和察氏液体培养基中，28℃发酵培养5d，以获得EPS；

(3)产EPS干物质量的计算：每个样品取5g培养液，60℃鼓风干燥烘箱烘至恒重，测样品干重；

(4)发酵基础培养基类型比较：在保持培养基中其他组分不变，分别以YEM培养基、CSE培养基和察氏培养基进行摇瓶发酵，以所产EPS的干物质的量和粘度为主要评价指标，根据不同培养基下定量发酵液的干物质量和粘度来确定最佳基础培养基；

(5)碳源、氮源的优化：通过单因素法对培养基中的碳源和氮源进行对比实验，找出最佳菌种产EPS的培养基碳氮源；其中：

1)碳源对PMKN150713菌发酵产EPS的影响

在保持培养基中其他组分不变，分别以原配方用量的蔗糖、葡萄糖、甘露醇和丁二酸代替基础发酵培养基中的碳源，进行摇瓶发酵，以EPS的粘度和定量发酵液的干物质量为主要评价指标，根据不同碳源条件下EPS的产出率，测干物质重量和粘度确定培养基中最佳碳源；

2)氮源对PMKN150713菌发酵产EPS的影响

在保持培养基中其他组分不变，以原配方用量的蛋白胨、酵母粉、硝酸钾、硫酸铵和磷酸铵代替基础发酵培养基中的氮源，进行摇瓶发酵，以EPS的干物质量和培养液粘度为评价指标，根据不同氮源条件下的EPS产干物质量和粘度确定最佳氮源；

(6)EPS粘度的测定：使用品氏粘度计测量培养液的粘性动力系数，进而确定不同培养基、C、N源对解磷菌产胞外聚合物粘度的影响，以不同培养基C、N源所产多糖的粘度为评价指标，确定EPS粘度最大的最佳培养基和N、N源；

(7)缓释磷肥试制：培养物经双层滤纸过滤后，含有大量活菌的黏稠EPS解磷固氮菌培养物，按每5g加入0.5g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g、3.0g磷酸二氢铵的量做6个对照组，用玻璃棒混合均匀，分别以烘箱低温28℃烘干、常温自然干燥、常温减压硅胶室干燥法和不干燥进行处理，并进行各对照组及干燥方法灭菌与不灭菌处理对照；

(8)包肥含水量的计算：先称每个对照组、重复组包肥的鲜重，然后108℃高温烘干至恒重，测得干重，用湿、干重差除以湿重即是包肥含水量；

(9)包肥含菌量的测定：以平板稀释法记录并统计，由所取样品质量、稀释倍数、涂抹和取样量换算包肥含菌数；

最大可能菌数cfu·g-1＝B×C/D×E/A

注：A:原材料质量g B:研磨液体积ml C:稀释倍数

D:涂抹液体积ml E:培养基菌落数

(10)磷溶出率的计算：包埋缓释磷肥的磷溶出率是鉴定样品能够减缓速溶性磷肥溶出包肥的程度，从而判断包埋有无意义，计算样品初期溶出率和微分溶出率：

1)初期溶出率：称取1g样品包肥，加入20倍重的水，28℃恒温侵泡24h，取出侵泡液，用土壤养分测试仪土壤类试剂测其P含量，每个处理重复3次；

初期溶出率％＝第一天浸出的养分量/试样中该养分的含水量×100％

2)微分溶出率：称取1g样品包肥，加入20倍重的水，28℃恒温侵泡7天，取出侵泡液，用土壤养分测试仪土壤类试剂测其P含量，每个处理重复3次。

微分溶出率％＝(溶解的成分量/试样中该成分的含量×100％-初期溶出率)×1/(放置天数-1)

(11)数据分析：数据为平均值±标准误means±SE，每处理4重复，制作出相关柱状图进行对比分析，同列柱状图上方不同小写字母表示处理之间差异显著性。