[发明专利]用于高通量分析的微流控细胞捕获和分析设备

说明书

提供了用于捕获、分离和处理单细胞的微流控装置。所述微流控装置包括细胞捕获室，其具有位于细胞捕获室内的细胞漏斗，从而引导细胞通过细胞捕获室流向一个或多个位于该漏斗下游的细胞捕获器，以接收流动的细胞。所述装置可进一步包括与细胞捕获室一体的辅助室，用于随后处理和分析所捕获细胞的内含物。还提供了细胞捕获和制备方法，其包括使细胞流经室，并使细胞经漏斗流向细胞捕获器，在所述捕获器内捕获预定数目的细胞，中断所述细胞流，使洗涤液流经所述室以从所述室中去除污染物，以及将所述预定数目的细胞封闭于所述室内。

发明背景

1.发明领域

本发明涉及微流控装置。具体地，本发明涉及微流控装置及其用途, 以及用于分析细胞的方法。

2.相关技术描述

单细胞代表基本生物单位。然而，大多数生物知识呈现为研究细胞 群而非单细胞的结果。难免存在基础和应用问题，如涉及干细胞分化的 转录控制、基因表达中的固有噪声和疾病起源的问题，这只能从单细胞 水平上来解决。例如，单细胞分析允许直接测量基因表达动力学或清楚 地鉴别共调控的基因，甚至存在会使普通群体测量不清楚的非同步性和 异质性时也是如此。类似地，单细胞方法在干细胞研究和癌症生物学中 至关重要，其中由于受纯化方案限制而分离的原代细胞群为异质的，并 且通常只有少数细胞群是最相关的。因此，高通量单细胞测量技术受关 注并在临床和研究环境中具有广泛的应用。

测量单细胞中转录水平的现有方法包括RT-qPCR(1)、使用数字PCR (2)的单分子计数，或杂交探针(3,4)以及新一代测序(5)。在这些方法中， 单细胞RT-qPCR提供了灵敏、特异和动态范围的综合优点，但其受低通 量、试剂费用高和难以准确测量低丰度转录本的限制(6)。

微流控装置使用活动阀门来定位和分离细胞，允许对单个微生物细 胞进行分离和基因组扩增(32)。遗憾的是，由于涉及操作阀门机构的手动 操作，该装置不能进行高通量分析。此外，所述装置不能使分离的细胞 在处理和分析之前从上清液中洗涤出来。反过来这会产生污染事件，并 进一步限制该装置的下游应用。

因此，微流体研究的目标是开发出可对单细胞中的转录进行可扩展 分析的综合技术。微流控系统提供了用于单细胞分析的众多优点：测量 的经济性、平行化和自动化，以及提高来自小量反应的灵敏度和精确度。 过去十年中，人们投入了大量精力用于研发在芯片上集成和可扩展的单 细胞遗传分析(7,8)。因此，微流控单细胞基因表达分析的许多基本功能 已经在分离包括细胞操作和捕获(9,10)、RNA纯化和cDNA合成(11-13)， 以及芯片外细胞分离cDNA合成和预扩增后的微流控qPCR(14)中得到展 示。具体地，最近已将微流控qPCR装置(Biomark动态阵列，Fluidigm公 司)应用到单细胞研究中(15,16)。尽管这些系统提供了高通量qPCR数据 读出，但是它们没有进行前段样品制备，且需要通过FACS或微量移液 管进行单细胞分离，然后在分析前进行芯片外处理和起始模板的预扩增。 将单细胞分析的所有步骤集成于一个能测量大量细胞的强大系统的关键 步骤还有待报道。Toriello等人描述了直接测量单细胞基因表达的集成装 置的单独示范，组合了RNA捕获、PCR扩增和使用集成毛细管电泳的扩 增子末端检测的所有步骤(17)。尽管该系统的工程复杂，通量被限制于每 轮4个细胞，细胞捕获需要细胞代谢标记，且所述分析不是定量的。

在许多类型的分析之前，需要分离单细胞或有限数目的细胞，这通 常需要使用细胞捕获机构。对于单细胞或少量细胞进行可靠和可扩展分 析的目标而言，低捕获通量和低捕获效率成为巨大的挑战。低捕获效率 需要成千上万个细胞以使在使用细胞系时少量单细胞测量不成问题，然 而，在使用稀少细胞类型如干细胞的原代样品时，这就成为一个大问题。 同样，对所捕获细胞和通过所述捕获器的细胞的观察表明，细胞捕获效 率取决于细胞大小，其可能潜在地将偏差引入到单细胞测量中。

发明概述