[发明专利]罗汉果单性结实雌株的培育方法

权利要求书

1.罗汉果单性结实雌株的培育方法，其特征在于，将嵌合基因2A11-iaaM整合至罗汉果雌株的基因组，使基因iaaM在罗汉果雌株中获得表达，从而得到罗汉果单性结实雌株。

2.如权利要求1所述的罗汉果单性结实雌株的培育方法，其特征在于，以农杆菌介导转化法将嵌合基因2A11-iaaM整合至罗汉果雌株的基因组。

3.如权利要求2所述的罗汉果单性结实雌株的培育方法，其特征在于，所述农杆菌介导转化法的过程为：在雌株罗汉果的愈伤组织诱导过程中利用已转入植物表达载体pBI121-2A11-iaaM的农杆菌进行侵染，并依次经过继代培养、增殖培养、生根培养得到罗汉果雌株幼苗，利用分子检测筛选获得基因iaaM表达的罗汉果雌株幼苗，将其炼苗、移栽和鉴定后获得罗汉果单性结实雌株。

4.如权利要求3所述的罗汉果单性结实雌株的培育方法，其特征在于，所述农杆菌介导转化法的具体步骤包括：

A、雌株罗汉果愈伤组织诱导过程的具体步骤包括：

A1、将罗汉果雌株无菌叶片用灭过菌的打孔器打出多个直径为0.5cm的圆片，将圆片的背面和叶脉划伤，并接种至第一诱导培养基上，黑暗条件下预培养4天获得侵染用罗汉果叶盘，所述第一诱导培养基的配方为：MS+TDZ0.7mg/L+IBA0.5mg/L；

A2、将经步骤A1诱导后的侵染用罗汉果叶盘浸泡至已转入pBI121-2A11-iaaM的农杆菌菌液中，于28℃下150rpm振荡10min，所述农杆菌菌液的OD600为0.3-0.5；

A3、将步骤A2得到的罗汉果叶盘接种在第二诱导培养基上，黑暗条件下共培养3天，所述第二诱导培养基的配方为：MS+TDZ0.7mg/L+IBA0.5mg/L+AS100μM；

A4、将步骤A3得到的罗汉果叶盘用无菌水清洗、无菌滤纸吸干后接种至第三诱导培养基上，光照条件下选择培养两周得到愈伤组织，所述第三诱导培养基的配方为：MS+TDZ0.7mg/L+IBA0.5mg/L+Kan5mg/L+Cef300mg/L；

B、继代培养的过程是将步骤A4中愈伤组织用无菌水清洗后接种至分化培养基上，在光照条件下继代培养至分化产生不定芽，所述分化培养基的配方为：MS+TDZ0.7mg/L+IBA0.5mg/L+GA30.5mg/L+芸苔素内酯0.5mg/L+Kan5mg/L+Cef100mg/L；

C、将已分化产生不定芽的愈伤组织转接至增殖培养基，光照条件下进行增殖培养，所述增殖培养基的配方为：MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.2mg/L+Kan5mg/L+Cef100mg/L；

D、增殖培养过程中不定芽长至2cm以上时，切下不定芽，并插入生根培养基中，关照条件下进行生根培养至长出不定根，所述生根培养基的配方为：MS+NAA0.5mg/L+IBA0.2mg/L+Kan5mg/L+Cef100mg/L。

5.如权利要求4所述的罗汉果单性结实雌株的培育方法，其特征在于，光照条件为：光照温度25±1℃、光照强度2000lx、光照时间12h/d。

6.如权利要求4所述的罗汉果单性结实雌株的培育方法，其特征在于，所述农杆菌菌液的制备方法如下：从﹣80℃冰箱取出已转入植物表达载体pBI121-2A11-iaaM的农杆菌菌液，在附加Kan 50μg/mL、rif 20μg/mL的YEB固体平板上进行划线，28℃培养48h，然后挑取单菌落，接种到10mL附加Kan 50μg/mL、rif 20μg/mL的YEB液体培养基中，在28℃、200rpm振荡培养48h，得到目的菌菌液，取目的菌菌液1mL加入50mL新配制的无抗生素的YEB液体培养基，同时加入100μM的AS，在28℃、200rpm振荡培养6h，使得菌液OD600为0.3-0.5。