[发明专利]大肠杆菌O157:H7单个活菌的快速检测方法及试剂盒

说明书

一种大肠杆菌O157:H7单个活菌快速灵敏定量检测方法及检测试剂盒。采用增菌、富集和纯化等前处理方法将大肠杆菌O157:H7进行富集纯化，然后采用特异性免疫荧光抗体标记大肠杆菌O157:H7，并辅以膜选择通透性荧光染料来标记区分死菌和活菌，再进行流式分析技术检测，通过计数不同荧光信号，直接获得大肠杆菌O157:H7活菌的浓度。本发明的检测方法具有准确定量、特异性强、灵敏度高、检测时间短、操作简便、可区分死活菌的优点。

技术领域：

本发明属于食品微生物检测领域，涉及大肠杆菌O157:H7的快速定量检测，特别是单个活菌的快速检测方法及试剂盒。

背景技术：

大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)是一种重要的食源性致病菌，属于肠杆菌科埃希氏菌属，是肠出血性大肠杆菌中最具代表性的血清型。它的感染剂量非常低，最低10个活菌就可能感染致病，主要引起人的出血性腹泻和肠炎，且并发溶血性尿毒综合症、血栓性血小板减少性紫癜等，严重的可致人死亡。因此能够快速准确的定量检测出食品和水中大肠杆菌O157:H7活菌，对食品安全和保障人民健康具有非常重要的意义。

传统培养法检测大肠杆菌O157:H7耗时费力，需要18小时以上时间才能完成检测。

现有的大肠杆菌O157:H7的快速检测技术存在以下缺点：

1、不能区分死菌和活菌

众所周知，只有活菌才有致病性，因此如果不清楚活菌量，即使是定量检测，也很难估计该菌的感染程度。

但目前国内外主流技术，包括免疫学方法、分子生物学方法、液相芯片法和流式计数法等。不仅检测时间仍然较长，而且难以区分死活菌。

因为，免疫学方法是通过抗原抗体相互反应的原理，它只能检测总的细菌抗原蛋白；而分子生物学方法是通过基因扩增原理，只能检测总的细菌核酸；液相芯片法是通过抗体捕获细菌抗原再通过抗体标记抗原进行检测，只能检测得出细菌表面抗原浓度；先前建立的流式计数法只能通过抗体捕获细菌，再通过细菌核酸染料进行标记，只能检测得到总的细菌浓度。以上方法均不能区分死菌和活菌。

2、检测灵敏度低于该菌的最低感染剂量(10CFU)，更不能检出单个活菌

大肠杆菌O157:H7的最低感染剂量是10CFU，现有液相芯片法和流式计数法的检测限都在10³CFU/mL以上，无法满足大肠杆菌O157:H7检测的基本需要。

比如，中国专利CN201611201541.6，用流式细胞术快速检测大肠杆菌O157:H7。操作步骤是将大肠杆菌O157:H7(E.coli O157:H7)用SybrGreen I原液进行染色后，再用B细胞捕获不同浓度大肠杆菌O157:H7，通过流式细胞仪检测对应的荧光强度，建立回归方程，然后每次按照操作步骤检测得到B细胞捕获的待测大肠杆菌的荧光强度后，通过程计算得到大肠杆菌O157:H7浓度。

但是，该方法检测到的大肠杆菌O157:H7是死菌和活菌的总浓度。此外，该专利的检测限是4.9×10⁴CFU/mL。如果只是单个菌落，无法检出。

又如，中国专利CN201110360550.0，公开了一种液相芯片检测大肠杆菌O157的方法

未采用流式分析，利用液相芯片，也不能区分死菌和活菌；而且得到的检测结果不是绝对定量方法，是相对定量。

另外，CN201110360550.0方法的检测限是10³CFU/mL。而该菌的最低感染剂量是10CFU。所以，此方法很难实际应用。

因此，快速检测，灵敏度高(检测限达到单个菌)，且能检出活菌数，是大肠杆菌O157:H7检测的实际需要，也是技术难点。

发明内容：