[发明专利]一种NK细胞的无血清培养方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，提供了一种NK细胞的无血清培养方法，包括如下步骤：(1)从外周血分离单个核细胞，重悬于无血清培养基中，调整单个核细胞浓度，培养箱中静置培养过夜；(2)第2天，从培养液中吸出悬浮细胞，接种于细胞培养瓶，补加无血清培养基，同时添加抗CD16抗体、IL2和IL3；第4天，补加无血清培养基，添加IL2、IL3，继续培养至第6天；(3)第7天，补加无血清培养基，添加IL15、α‑半乳糖神经酰胺，继续培养至第14天；(4)离心收集NK细胞，使用流式抗体鉴定NK细胞表型。本发明的优点在于：采用无血清培养方法，通过14天的体外培养，获得90％纯度以上、扩增倍数80倍以上的NK细胞。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种NK细胞的无血清培养方法。

背景技术

自然杀伤细胞(NK细胞)是固有免疫系统中最重要的效应细胞，NK细胞具有强大的抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节等功能，在肿瘤免疫治疗相关领域具有良好的应用前景。

NK细胞具有特殊的靶细胞识别机制，无须接触抗原分子即可杀伤肿瘤细胞，并且不同于T细胞的MHC限制性杀伤特性，NK细胞是非MHC限制性，通过释放杀伤介质主要有颗粒酶素和穿孔素使肿瘤细胞发生凋亡，表达TNF家族分子启动ADCC抗体依赖的细胞毒作用杀伤肿瘤细胞。

外周血中NK细胞含量较少，并且目前市面上多采用含血清培养基培养NK细胞，由于血清成分非常复杂、血清批次间差异大，并且可能含有病原性物质，对细胞制品质量造成严重影响。

据此，目前急需一种细胞纯度高、扩增倍数大的NK细胞的无血清培养方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种细胞纯度高、扩增倍数大的NK细胞的无血清培养方法。

本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

一种NK细胞的无血清培养方法，包括如下步骤：

(1)外周血单个核细胞的分离

从25-35mL外周血分离单个核细胞，重悬于无血清培养基中，调整单个核细胞浓度至(1-3)x10⁶细胞/mL，培养箱中静置培养过夜；

(2)NK细胞的分离培养

第2天，从获得的培养液中吸出悬浮细胞，接种于新的细胞培养瓶中，并补加无血清培养基至45-55mL，同时添加150-250ng/mL抗CD16抗体、450-550U/mL IL2(白细胞介素-2)和15-25ng/mL IL3(白细胞介素-3)；

第4天，补加无血清培养基至95-105mL，同时添加450-550U/mL IL2(白细胞介素-2)、15-25ng/mL IL3(白细胞介素-3)，继续培养至第6天；

(3)NK细胞的继续培养

第7天，补加无血清培养基至195-205mL，并添加45-55ng/mL IL15(白细胞介素-15)、95-105ng/mL NK细胞激活剂α-半乳糖神经酰胺，继续培养至第14天；

(4)离心收集NK细胞

第14天，离心收集NK细胞，使用流式抗体鉴定NK细胞表型。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中于36-38℃、4％-6％CO₂培养箱中静置培养过夜。

作为本发明的优选方式之一，所述培养箱的具体培养条件为37℃，5％CO₂。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中细胞培养瓶为T175细胞培养瓶。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中添加的IL15具体浓度为50ng/mL。