[发明专利]RAGE稳定低表达的宫颈鳞癌CaSki细胞的构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种RAGE稳定低表达的宫颈鳞癌CaSki细胞的构建方法及其应用，构建方法主要包括：构建慢病毒干扰质粒pLKO.1‑TRC‑shRAGE，包装慢病毒载体，收毒及扩增。本发明的RAGE干扰慢病毒能下调宫颈鳞癌CaSki细胞中RAGE蛋白的表达，抑制CaSki细胞的增殖。

技术领域

本技术涉及一种RAGE稳定低表达的宫颈鳞癌CaSki细胞的构建及其应用

背景技术

宫颈癌是威胁女性健康的恶性肿瘤之一，是全球妇女第三大常见的癌症，每年约有52万新发病例。高危型HPV持续感染被认为是宫颈癌从癌前病变发展到宫颈癌的主要原因，其亚型主要为HPV16型和HPV18型，其中HPV16最常见。CaSki系HPV 16、18均阳性，小肠肠系膜转移的宫颈鳞癌细胞，是宫颈癌研究常用的细胞系。

晚期糖基化终末产物受体(The receptor for advanced-glycation endproducts，RAGE)基因位于人染色体6p21.3上，RAGE蛋白是由404个氨基酸组成的、具有多配体的一种跨膜信号受体蛋白,其完整的结构包括胞内域，胞膜域及胞外域3部分。其中胞外域含有3种免疫球蛋白结构，即为配体结合部位，可与AGEs、高迁移率蛋白B1(highmobility group B1，HMGB1)、S100/钙粒蛋白和β淀粉样肽(β-amyloid protein，Aβ)等配体相互作用，激活细胞内相关信号通路，进而引起细胞功能的紊乱，导致疾病的发生发展。近年来研究表明，RAGE参与多种恶性肿瘤的发生发展，如食管癌、口腔鳞癌、喉癌和肝癌等。

本课题组前期研究中，采用免疫组织化学检测宫颈鳞癌、宫颈上皮内瘤变及慢性宫颈炎组织中RAGE蛋白的表达情况，结果发现RAGE蛋白在鳞癌组织中表达量最高，宫颈上皮内瘤变组织次之，而慢性宫颈炎组织则最低。提示RAGE在宫颈鳞癌的发生发展中起一定作用，但具体机制尚未明确。

目前尚未有现成的宫颈鳞癌CaSki细胞RAGE低表达模型供研究，因此亟待建立合适的RAGE低表达的宫颈鳞癌CaSki细胞模型。

发明内容

本发明的目的在于提供一种RAGE稳定低表达的宫颈鳞癌CaSki细胞，通过慢病毒介导RAGE的低表达，探讨RAGE对宫颈鳞癌CaSki细胞增殖的影响，为宫颈癌的治疗提供新的思路和依据。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明公开了一种RAGE稳定低表达的宫颈鳞癌CaSki细胞的构建方法，包括构建慢病毒干扰质粒pLKO.1-TRC-shRAGE，包装慢病毒载体，收毒及扩增。

具体构建方法的步骤如下：

1.载体及目的基因的信息

(1)慢病毒载体pLKO.1-TRC图谱如附图1，U6启动子驱动RNA聚合酶III转录以产生shRNA转录物。EcoR I和Age I为酶切位点。该载体含有嘌呤霉素抗性，可用嘌呤霉素筛选。

(2)目的序列如下：

siRNA序列：ggCTggTgTTCCCAATAAg。通过插入发卡结构序列TCAAGAG，AgeI酶切位点序列CCGGT，EcoRI酶切位点序列AATTC，得到目的shRAGE序列如下：

RAGE-AgeI-F:CCGGTAAAAAggCTggTgTTCCCAATAAgTCAAGAGCTTATTgggAACACCAgCC(SEQ ID:NO.1)

RAGE-EcoRI-R:AATTCggCTggTgTTCCCAATAAgTCAAGAGCTTATTgggAACACCAgCCTTTTT(SEQ ID:NO.2)

2.慢病毒载体pLKO.1-TRC用EcoR I和Age I双酶切，酶切完成后胶回收扩增。