[发明专利]RAGE稳定低表达的宫颈鳞癌CaSki细胞的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种 RAGE 稳定低表达的宫颈鳞癌 CaSki 细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括构建慢病毒干扰质粒 pLKO.1-TRC-shRAGE，包装慢病毒载体，收毒及扩增，其中具体构建步骤如下：

（1）目的序列如下：

siRNA 序列：ggCTggTgTTCCCAATAAg，通过插入发卡结构序列 TCAAGAG，AgeI 酶切位点序列 CCGGT，EcoRI 酶切位点序列 AATTC，得到目的shRAGE 序列如下：

RAGE-AgeI-F:CCGGTAAAAAggCTggTgTTCCCAATAAgTCAAGAGCTTATTgggAACACCAgCC

RAGE-EcoRI-R:AATTCggCTggTgTTCCCAATAAgTCAAGAGCTTATTgggAACACCAgCCTTTTT ；

（2）目的单链片段经 PCR 仪退火成带粘性末端的双链片段；

（3）慢病毒载体 pLKO.1-TRC 双酶切： 将慢病毒载体 pLKO.1-TRC 用 Age I 和 EcoRI 双酶切，酶切完成后胶回收纯化；

（4）将步骤(2)得到的产物和步骤(3)经过双酶切的载体进行连接、转化、鉴定，即可得到慢病毒干扰质粒 pLKO.1-TRC-shRAGE；

（5）取慢病毒干扰质粒 pLKO.1-TRC-shRAGE 与两个慢病毒包装质粒 psPAX2 和pMD2.G，共转染 HEK293 细胞得到干扰慢病毒；

（6）将干扰慢病毒转染宫颈鳞癌 CaSki 细胞，得到 RAGE 稳定低表达的宫颈鳞癌CaSki 细胞。

2.如权利要求 1 所述的 RAGE 稳定低表达的宫颈鳞癌 CaSki 细胞的构建方法，其特征在于，其中步骤（6）干扰慢病毒转染宫颈鳞癌 CaSki细胞的步骤包括：

a.细胞培养：取宫颈鳞癌 CaSki 细胞接种于培养皿中；待细胞融合度达 40%～60%时，加入终浓度为 8μ g/ml 凝聚胺作用细胞 0.5h；

b.将步骤（5）的干扰慢病毒稀释 10 倍后感染细胞；感染 24h 后，更换成新的完全培养基；

c.用终浓度为 2μ g/ml 的嘌呤霉素进行筛选，隔天更换含嘌呤霉素的培养液，观察嘌呤霉素对于未转染细胞的杀伤效果，筛选 1～2w，筛选后的存活细胞，得到 RAGE 稳定低表达的宫颈鳞癌 CaSki 细胞。

3.RAGE 稳定低表达的宫颈鳞癌 CaSki 细胞，其特征在于，所述宫颈鳞癌 CaSki 细胞采用如权利要求 1 所述的 RAGE 稳定低表达的宫颈鳞癌 CaSki 细胞的构建方法获得。