[发明专利]一种用于扩增重组犬腺病毒CAV2的稳定细胞系MDCK及其构建方法

说明书

本发明提供了一种表达犬腺病毒E1A基因和E1B基因的稳定细胞系、其构建方法和应用，通过将E1区的两个基因E1A和E1B分别构建到慢病毒载体中，然后让MDCK细胞分别稳定的表达E1A和E1B基因，构建了MDCK‑E1A‑E1B的稳定细胞系。本发明将片段较长不易构建的E1基因拆成了两段片段较短易于构建的E1A和E1B基因，提高了构建稳定细胞的成功率；E1A和E1B基因分别带有不同颜色的荧光蛋白，便于实时监控稳定细胞的稳定性。实验证明MDCK‑E1A‑E1B稳定细胞系比MDCK‑E1稳定细胞系扩增犬腺病毒滴度更高，为犬腺病毒在病毒活载体疫苗、基因治疗、癌症治疗等领域的应用上奠定了很好的基础。

技术领域

本发明属于稳定细胞系的构建领域，更具体地，涉及一种用于扩增重组犬腺病毒CAV2的稳定细胞系MDCK及其构建方法。

背景技术

腺病毒载体自上世纪八十年代以来以其良好的发展前景，成为了人们研究的热点。目前腺病毒载体被广泛的应用于生产病毒活载体疫苗、基因治疗、癌症治疗等领域。然而腺病毒本身的安全性以及免疫原性等也限制了腺病毒载体的临床应用，人们通过不断地研究和学习发现犬腺病毒CAV2只能在犬科动物的细胞中复制生长不能在人，猴等细胞中生长，即使在293，Hela细胞中有低水平的复制但却不能包装成病毒颗粒或扩散，安全性高，同时人体内不存在CAV2的免疫答应，因此犬2型腺病毒CAV2的研究引起了国内外学者兴趣。随着研究的深入，腺病毒载体的缺失也越来越多，这样也导致在腺病毒载体的包装上也变得越来越困难，因此，包装辅助细胞系的建立就变得尤为重要。

据文献报道对腺病毒包装其关键作用的部分为腺病毒E1区的基因，因此目前主要通过把E1基因构建到MDCK上来建立犬腺病毒复制生长的辅助细胞系。然而直接将E1基因构建到MDCK中存在细胞系稳定性不高，犬腺病毒增殖率不高的问题。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种用于扩增重组犬腺病毒CAV2的稳定细胞系MDCK及其构建方法，其充分结合犬腺病毒CAV2扩增的特点和需求，针对性地对其包装辅助细胞系进行重新设计和构建，相应获得了一种细胞稳定性高、犬腺病毒增殖率高的MDCK稳定细胞系。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种用于表达犬腺病毒E1A基因和E1B基因的稳定细胞系，所述稳定细胞系为MDCK细胞，其以慢病毒作为载体，在所述MDCK细胞的基因组中先后随机插入E1A基因和E1B基因，所述E1A基因和E1B基因均来源于犬腺病毒CAV2；该稳定细胞系能够分别表达所述E1A基因和所述E1B基因。

按照本发明的另一个方面，提供了一种用于表达犬腺病毒E1A基因和E1B基因的稳定细胞系的构建方法，将犬E1A基因和犬E1B基因分别构建到慢病毒载体中，分别得到表达E1A基因的慢病毒和表达E1B基因的慢病毒；用所述表达E1A基因的慢病毒感染MDCK细胞，得到MDCK-E1A细胞系；再用所述表达E1B基因的慢病毒感染所述MDCK-E1A细胞系，获得能稳定表达所述E1A基因和所述E1B基因的稳定细胞系MDCK-E1A-E1B。

优选地，所述的构建方法，包括如下步骤：

(1)从载体pCAV2上分别扩增E1A和E1B基因，先将E1A片段用同源重组的方法克隆到含有报告基因mCherry的慢病毒载体pFUGW上，构建重组质粒pFUGW-his-mCherry-2a-E1A；再用同样的方法将E1B片段克隆到含有报告基因GFP和筛选基因puro的慢病毒载体pCDH上，构建重组质粒pCDH-his-GFP-2A-E1B-puro；