[发明专利]一种胎盘间充质干细胞的制备方法

权利要求书

1.一种胎盘间充质干细胞的制备方法，其特征在于：具体制备方法为：

步骤一、选取足月顺产或剖宫产的盘状胎盘，确保无胎粪等污染，剪取胎盘底蜕膜面的组织，将底蜕膜面的细胞即靠近母体面的表层减去，减去之后挑颜色鲜红的组织剪取；

步骤二、将剪取的组织块在含有庆大霉素的生理盐水中清洗至鲜红色，所述的生理盐水的配制方法为：在500mL生理盐水加入2支庆大霉素即可；

步骤三、挑取颜色鲜亮的组织，将组织放入10cm平皿中，倾斜平皿，使组织位于高处，剪成肉泥，注意无菌操作；

步骤四、将剪碎的组织用细胞刮刀平铺于T75cm2细胞培养瓶中，做好标记；

步骤五、将细胞培养瓶倒扣，且细胞培养瓶为设置有通气滤膜的培养瓶，其中有组织块的血培养面位于上方，缓慢加入6mL无血清培养基，培养基位于下方，-XF人间充质干细胞基础培养基及添加物，产品号分别是：10151A，10151B；两者以10：1混合；混合后加入L-gln，使其终浓度达到2mM，放入37℃培养箱中，5％CO2，放置2h，拧紧瓶盖；

步骤六、将培养瓶正置，此时应确保培养液能覆盖住每块组织，静置培养；

步骤七、三天后观察组织块，注意动作要轻，尽量不要晃动；

步骤八、七天后再半量换液，此后均半量换液；

步骤九、待细胞汇合度达到80％左右时，进行传代培养；

步骤十、将培养液去除，用6mL生理盐水冲洗一遍，加入2mL 0.25％Trypsin-EDTA，放入37℃培养箱中，约3-5min，待细胞变圆时，停止消化，吸取消化液到含有3ml培养基的离心管里，加入6mL-XF人间充质干细胞基础培养基及添加物至培养瓶终止消化，轻轻吹打贴壁的细胞，使细胞均匀分布于溶液中，吸取细胞到新的离心管中，1500rpm，离心5min；

步骤十一、弃去上层溶液，收集细胞，加入传代培养基，其中完全培养基-XF：MSCGM-CDTMBulletKit＝3：1，按着1×105个/mL细胞量进行传代培养；

步骤十二、待细胞生长至80-90％密度时，收获细胞，进行冻存。