[发明专利]植物作为宿主在表达利妥昔抗体中的应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物作为宿主在表达利妥昔抗体的应用。本发明利用植物例如生菜作为重组蛋白质生产的有效表达平台，利用简单以及有效的农杆菌介导真空渗透方法来表达利妥昔单克隆抗体(Rituximab，Rituxan，美罗华)。该表达体系确定植物外源蛋白在农杆菌侵染4d后就可以收集。利用SDS‑PAGE法确定重组利妥昔抗体成功表达。伯基特淋巴瘤抑制实验证明生菜生产的利妥昔抗体具有抑制淋巴瘤细胞的生物学活性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物作为宿主在表达利妥昔抗体中的应用。

背景技术

淋巴瘤是恶性血液肿瘤的一种。从发病率和死亡率上看，根据《中国肿瘤登记年报》的数据，2003至2013年间，恶性淋巴瘤的发病率约为6.68/10万，每年新发病数近9万例，位列所有恶性肿瘤发病率第八位。男性发病率高于女性，致死率为3.75/105，位列第十位。从疾病分类上看，淋巴瘤通常分为两大类：霍奇金氏淋巴瘤(HL占所有淋巴瘤的10％)和非霍奇金氏淋巴瘤(NHL，占所有淋巴瘤的90％)，共计有70余种亚型。

利妥昔单克隆抗体(Rituximab，Rituxan，美罗华)是美国食品药物管理局(FDA)批准用于治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)，某些类型的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，以及某些自体免疫性疾病。利妥昔单抗是一种嵌合鼠/人的单克隆抗体，利妥昔单抗经常与其它药物联合使用来治疗华氏巨球蛋白血症(WM)，包括合并使用化疗和其它标靶治疗。利妥昔单抗针对正常B细胞和恶性B细胞上的CD20抗原。利妥昔单抗与CD20抗原结合之后，身体的天然免疫防御被招募来攻击和杀死被利妥昔单抗标记的B细胞。但在造血干细胞，不成熟B细胞，正常血浆细胞，或其他正常组织中没有CD20抗原，所以不会被利妥昔单抗攻击。这使得健康的B细胞在治疗后得以再生。

自1997年美国上市以来销售快速增长，2012年销售额已经超过了“70亿美元”。现阶段主要利用动物细胞生产利妥昔单抗。但是动物细胞培养需要价格昂贵的培养液，严格的厂房条件，操作复杂，时间周期至少两周，而且动物细胞生产能力低，生产成本极高。有时候动物细胞所带的病毒可以侵染人类，安全性低。因此，提供一种利妥昔抗体的表达方法具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了植物作为宿主在表达利妥昔抗体中的应用。本发明利用植物尤其是生菜作为重组蛋白生产的高效平台技术，表达了利妥昔抗体。并且在温和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明植物尤其是生菜表达平台可以成功用来生产利妥昔抗体蛋白。时间短(4d)，纯化简单，生产便捷。消除基因污染，消除感染人体的潜在病虫害等。大大降低生产成本，提高产品安全性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了植物作为宿主在表达利妥昔抗体中的应用。优选的，所述抗体为单克隆抗体。所述植物选自生菜、白菜、玉米、大豆、烟叶或小麦；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。

本发明还提供了一种表达载体，包括利妥昔的重链序列或轻链序列以及载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述利妥昔的重链序列或轻链序列为将利妥昔重链、利妥昔轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得的优化的利妥昔的重链序列或优化的利妥昔的轻链序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述优化的利妥昔的重链序列如SEQ ID No.1所示；所述优化的利妥昔的重链的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述优化的利妥昔的轻链序列如SEQ ID No.3所示；所述优化的利妥昔的轻链的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

在本发明的一些具体实施方案中，所述载体为双元植物载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体的构建方法包括如下步骤：