[发明专利]一种特异性刺激抗原的制备方法

说明书

本发明涉及一种特异性刺激抗原的制备方法，使用跨物种蛋白作为特异性刺激抗原，具体的，利用TGF‑β抗体跨物种反应的特性，使用斑马鱼蛋白作为制备人抗体特异性刺激抗原。所述的跨物种蛋白制备方法为：对斑马鱼抑制素B全基因序列进行优化；设计全长拼接引物；构建重组质粒；转染宿主细胞制备抑制素B蛋白，作为制备人抑制素B特异抗体的抗原。本发明采用以跨物种蛋白作为特异性刺激抗原的方法，以人工合成的跨物种抑制素B蛋白为抗原进行免疫试验，获得了高纯度的抑制素B抗体，为人特异性抗体的获得提供了一种新的免疫策略。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体来说，涉及一种特异性刺激抗原的制备方法。

背景技术

抑制素是转化生长因子β(TGF-β)超家族成员之一，是由α和β两个亚单位构成的二聚体糖蛋白激素。α亚单位相对分子质量(Mr)是20000；β亚单位相对分子质量(Mr)是5000-15000，并有βA和βB两种亚型。α和β通过二硫键结合，形成抑制素A(αβA)和抑制素B(αβB)，另外两个β亚基还可形成活化素A(βAβA)、活化素B(βBβB)以及活化素AB(βAβB)。生物体内INH-B有多种分子形式存在，包括成熟(Mr：32000)和不完全成熟(又称前体)的αβ二聚体分子及游离α亚基。用酶联免疫吸附试验(ELISA)还可检测出血浆中的α亚单位前蛋白(Pro-αC)，该蛋白可能是与其他抑制素有交叉反应的前蛋白系列。βB亚基前体为1个由392 个氨基酸(aa)残基组成的肽链，成熟βB亚基(115aa)位于此肽链的碳端。不同哺乳动物的βB亚基全长编码区核苷酸序列的同源性大于80％，成熟区核苷酸序列的同源性大于90％，成熟区推导的氨基酸序列的同源性大于96％。抑制素B这种在各个物种间的序列保守性，又导致针对该分子的抗体具有跨物种反应的特性。

抑制素/激活素这种亚基多聚体结构，并且不同的亚基自身具有序列机构相似性，造成了在用各自抗体检测时，抗体对各自天然存在的多种聚合体抗原识别的特异性大大降低，所以对各种亚基聚体抗原的实际检测中存在很大的交叉反应，给蛋白检测尤其是酶联免疫吸附试验(ELISA)带来结果上的误差，导致检测结果的准确性无法保证，抑制素B分子这一特性尤为突出。

抗体制备最关键的是抗原的选择，目前在INH-Bβ亚基抗体制备中抗原来源基本都是合成多肽，且多为成熟区域C-末端序列，利用合成多肽免疫动物(兔或小鼠)，制备多克隆抗体或者单克隆抗体，并且该多肽同时被用作检测试剂盒的标准曲线或/和质标品，但是检测目标实为天然抑制素B分子，所以检测结果并不准确，需要对的检测结果用天然样品进行校正。标准品也无法像其他蛋白检测那样用倍比稀释的方法做标准曲线，提高了标准曲线的准备难度，和操作的复杂性。

应用基因工程技术合成抑制素B全基因序列，制备跨物种重组蛋白，可作为制备人源蛋白抗体的抗原，实现以跨物种蛋白为抗原制备高特异性抗体的技术方案。

发明内容

属于TGF-β超家族的抑制素B在检测上具有容易与抑制素A激活素B发生交叉反应的特点，出现该问题的主要原因是制备出的抗体不能特异识别天然结构的人抑制素B分子，市面上的针对抑制素B分子βB链的抗体，还与VA链和/或α链存在交叉反应。为克服现有技术的不足，本发明旨在解决制备具有特异性反应抗体所需要的特殊抗原制备方法的问题。

为达到上述目的，本发明采用以下实施方案：

利用抑制素B蛋白分子各亚基间具有序列相似性以及亚基序列高度保守性的特点，及TGF-β超家族蛋白的抗体具有较强跨物种反应的特性，以跨物种蛋白为抗原制备高特异性抗体。可利用斑马鱼蛋白作为制备人源蛋白抗体的抗原。例如：为了制备与人抑制素B反应特异性高的抗体，采用斑马鱼抑制素B蛋白作为抗原。

本发明的具体实施方案包括：

a.使用跨种属蛋白作为特异性刺激抗原。

b.使用斑马鱼蛋白作为制备人抗体特性刺激抗原。