[发明专利]一种靶向结肠癌的重组蛋白及其制备方法和用途

说明书

本发明涉及一种靶向结肠癌的重组蛋白及其制备方法和用途，属于基因工程领域。一种靶向结肠癌的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所述，纯化方法包含了硫酸铵沉淀法、疏水层析、离子交换层析和分子排阻层析，均是以蛋白质的理化性质分离蛋白的温和方法，避免了使用亲和层析类等较为剧烈的纯化方式，在满足纯度的同时，减少了蛋白活性的损失。纯化后的靶向结肠癌的重组蛋白经细胞水平和动物实体瘤水平试验证实，其具有显著的抗肿瘤活性，为结肠癌的个体化治疗提供了新的方向。

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其是指靶向结肠癌的重组蛋白及其制备方法和用途。

背景技术

结肠癌(Colorectal cancer,CRC)是人类高发恶性肿瘤之一，其发病率一直呈上升趋势，全球每年患结肠癌的病例超过1亿人，在全球恶性肿瘤发病率中已上升至第三位，其死亡率居恶性肿瘤死因的第二位。在我国，结肠癌的发病率和死亡率均保持上升趋势，其发病递增速度为世界平均数的两倍，已位于我国恶性肿瘤发病率的第四位，严重危害人类健康。目前，结肠癌的治疗手段以手术治疗为主，辅以全身或局部化疗、放疗等治疗手段，但术后肿瘤易复发，且化疗、放疗毒副作用大，易引起肿瘤细胞耐药。40年前，Moolten FL等提出的重组毒素概念为癌症的诊疗带来一片光明。重组毒素的策略是基于抗原-抗体、激素-受体特异性结合的特性，以肿瘤细胞表面特有的标志物、特异受体或高表达的受体为靶标，使毒素集中于肿瘤细胞周围，最终将肿瘤细胞杀死而对正常细胞无损害。近年来，随着基因工程技术的发展，利用基因重组技术将负责细胞识别的抗体片段或激素基因与毒素活性片段的基因进行融合，经表达及纯化制备得到新型重组毒素。新型重组毒素具有靶向性好、杀伤能力强、毒性低、分子量小、免疫原性低、产生的分子均一、成本低易于改造、能够大量生产等优点，具有良好的开发应用前景。

近年来，诸多国内外学者开展大量涉及胃肠道肿瘤生长、侵袭、转移等发病机制或信号传导通路的研究。随着研究的深入，人们发现胃肠道肿瘤细胞表达的胆囊收缩素受体(Cholecystokinin receptor,CCKR)可通过自分泌或旁分泌途径促进肿瘤细胞的增生和转移，即肿瘤细胞既合成分泌胆囊收缩素(Cho1ecystokinin,CCK)和胃泌素(Gastrin,GS)，又表达CCKR，前者作为生长因子与分泌CCK和GS的细胞或周围细胞表面的CCKR结合，产生增殖信号传入核内，引起肿瘤细胞生长，尤其是2型胆囊收缩素受体(CCK2R)在大多胃癌、结直肠癌细胞及癌旁组织细胞膜上高表达，而正常组织表达量极低，与结肠癌的发生发展过程有密切关系，是结直肠癌诊断和治疗的理想靶点。

胆囊收缩素(Cholecystokinin，CCK)是十二指肠及近端空肠离散的肠内分泌细胞(I型)和大脑神经元合成分泌的，其主要的生理学作用是刺激胰腺分泌、胆囊收缩、产能、抑制胃酸分泌、肠能动性、促进细胞生长、基因表达、蛋白合成和饱腹感等。另外，CCK也能够促进外分泌性胰腺的生长，大量实验证实，CCK与动物的进食、记忆、疼痛、焦虑等精神状态有关。CCK在人体内以多种长短不同的分子形式存在，均由含115个氨基酸残基的CCK原加工剪切形成的多肽，包括CCK-83、CCK-58、CCK-39、CCK-33、CCK-25、CCK-22、CCK-18、CCK-12、CCK-8、CCK-7、CCK-6、CCK-5以及CCK-4。

绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas Exotoxin,PE)是制备重组毒素的理想毒素分子，其高效杀伤活性及细胞杀伤机制已得到详细阐明。对PE分子进行加工修饰，并与人工靶向元件(如受体配基和抗体片段)结合，使其发挥细胞毒性潜能，可选择性消除某些特异性肿瘤细胞。Ira Pastan等证明一个毒素分子在35min内可成功的失活300个核糖体，理论上一个重组毒素分子与肿瘤细胞结合后即可将该细胞杀死，但由于毒素内化效率、细胞内Furin酶切割效率的影响(Furin酶对PE的切割效率为5％-15％)，杀死一个肿瘤细胞需要400-1000个毒素分子。这要求在杀死靶细胞时需要一定量的毒素分子，确保了少量非特异性结合至正常细胞表面的毒素不能发挥细胞毒作用，从而保证了对正常细胞的安全性，因此在抗癌药物的应用中具有很高的价值。