[发明专利]一种靶向结肠癌的重组蛋白及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种靶向结肠癌的重组蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No.2所述。

2.编码如权利要求1所述的靶向结肠癌的重组蛋白的核苷酸序列，其特征在于：该核苷酸序列如SEQ ID No.1所述。

3.如权利要求1所述的靶向结肠癌的重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

(一)通过基因扩增获得靶向结肠癌的重组蛋白的重组DNA，核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，通过NcoI和BamHI酶切位点，将该重组DNA克隆入pET28a载体，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取单克隆细胞培养保存；

(二)将重组大肠杆菌BL21(pET28a-rCCK8PE38)接种于2xYT培养基中，37℃持续摇培至OD600达到0.5，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷IPTG至终浓度0.6mM，27℃摇培5小时后，离心收集菌体，12000g，15min，4℃；

(三)按照1g：20ml的比例用磷酸盐缓冲液PBS重悬菌体，使用超声破碎仪破碎菌体，离心收集上清中的可溶性蛋白，12000g，120min，4℃；

(四)将步骤(三)收集的蛋白溶液进行纯化，步骤如下：

a)在步骤(三)获得的蛋白溶液中缓慢滴加饱和硫酸铵溶液，至终饱和度10％，低温离心，12000g，5min，4℃，收集上清液；在上清液中继续滴加饱和硫酸铵溶液，至终饱和度30％，低温离心，12000g，5min，4℃，收集沉淀；

b)使用上样缓冲液，20mmol/L Tris-HCl,3mol/L NaCl,1mmol/L EDTA,pH 7.4，重悬步骤a)沉淀物，经蛋白纯化系统，上样到疏水层析介质Phenyl HP，再以3-0mol/L氯化钠浓度梯度洗脱，收集0.9-0mol/L氯化钠浓度洗脱下的蛋白溶液；

c)将步骤b)收集的蛋白溶液经蛋白纯化系统，上样到分子排阻层析介质G-25除盐，其缓冲体系被置换为：20mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA,pH 6.0；

d)将步骤c)获得的蛋白溶液经蛋白纯化系统，上样到离子交换层析介质DEAEFF，再以0-1mol/L氯化钠浓度梯度洗脱，收集0.5-0.7mol/L氯化钠浓度洗脱下的蛋白溶液；

e)将步骤d)获得的蛋白溶液经蛋白纯化系统，上样到分子排阻层析介质G-25除盐，其缓冲体系被置换为保存液，50mmol/L Na3PO4，100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，pH7.4，经上述纯化后的靶向结肠癌的重组蛋白的纯度可达95％以上。

4.如权利要求1所述的一种靶向结肠癌的重组蛋白在制备治疗结肠癌药物中的应用。

5.如权利要求4的所述的一种靶向结肠癌的重组蛋白在制备治疗结肠癌药物中的应用，其特征在于：靶向结肠癌的重蛋白作用于HCT116人结肠癌裸鼠模型，能够显著抑制肿瘤的生长和扩散。