[发明专利]基于荧光共振能量转移的均相荧光检测血清蛋白的方法

权利要求书

1.一种基于荧光共振能量转移的均相荧光检测血清蛋白的方法，其特征在于，以荧光染料标记纳米抗体为能量供体，另以相应荧光淬灭剂标记同种纳米抗体或者配对纳米抗体为能量受体，具体包括如下步骤：

步骤1、以荧光染料标记待测抗原的纳米抗体；

步骤2、以相应荧光染料淬灭剂标记同种纳米抗体或者配对纳米抗体，所述荧光染料和相应荧光染料淬灭剂为符合FRET特征的试剂对；

步骤3、配制几个已知浓度梯度的标准抗原溶液，在几个所述标准抗原溶液中均加入步骤1获得的荧光标记纳米抗体和步骤2中获得的淬灭剂标记抗体，在pH6-8的缓冲液中混合均匀，温育30min，得到不同的混合体系；

步骤4、免疫反应完成后，得到所述几个已知浓度梯度的标准抗原溶液的的荧光强度，以及荧光强度的猝灭程度与浓度之间的关系，测试血样中未知浓度待测抗原样本的荧光强度，根据所述关系即可得到待测抗原的浓度；

待检测的抗原为分子量小于或等于25kDa的球蛋白或者分子量小于或等于15kDa左右单体组成的多聚体蛋白，

其中待检测的抗原为分子量小于或等于25kDa的球蛋白时，检测方式为分别采用荧光染料和淬灭剂标记配对纳米抗体对，纳米抗体对针对的是球蛋白上不同的抗原决定簇；

待检测的抗原为分子量小于或等于15kDa左右单体组成的多聚体蛋白时，检测方式为分别采用荧光染料和淬灭剂同时标记同种纳米抗体，同种纳米抗体针对的是多聚体蛋白每个单体的同一个位置的抗原决定簇。

2.如权利要求1所述的基于荧光共振能量转移的均相荧光检测血清蛋白的方法，其特征在于，所述步骤4中具体方法为：免疫反应完成后，以所用能量供体的最大激发波长为激发光，以所用的能量受体的发射波长检测混合体系的荧光强度，采用去卷积法，计算得到溶液的荧光强度；根据荧光强度的淬灭程度，制作不同浓度待测抗原的标准曲线，进行公式拟合，得到待测抗原的计算公式；测试血样中未知浓度待测抗原样本，将测得的荧光强度代入所述的计算公式，得到待测抗原的浓度。

3.如权利要求1所述的基于荧光共振能量转移的均相荧光检测血清蛋白的方法，其特征在于，所用的荧光染料为5-羧基荧光素(FAM)、四甲基罗丹明(TMR)、Alexa-Fluor荧光团、BODIPY染料、ATTO染料、花青染料、量子点和稀土元素荧光剂。

4.如权利要求1所述的基于荧光共振能量转移的均相荧光检测血清蛋白的方法，其特征在于，所用的荧光染料淬灭剂选自DABCYL、BHQ1、BHQ2、QSY7、QSY9、QSY21、QSY35、ATTO540Q、ATTO580Q、ATTO612Q、DYQ660和DYQ661，荧光染料和荧光淬灭剂的配对原则为荧光染料的发射波长为荧光淬灭剂的吸收波长。

5.如权利要求1所述的基于荧光共振能量转移的均相荧光检测血清蛋白的方法，其特征在于，所述纳米抗体来自羊驼、骆驼或者鲨鱼。