[发明专利]一种艾草中拮抗菌株筛选及纯化的生产方法

说明书

本发明涉及一种艾草中拮抗菌株筛选及纯化的生产方法，干野生艾草叶用粉碎机将其粉碎成粉末，加入乙醇溶液，提取出艾草提取液；制备不同稀释梯度的艾草提取液稀释液，用移液枪分别吸取100μl不同稀释梯度的艾草提取液稀释液于平板中进行涂布，于恒温培养箱中培养；艾草内生细菌单菌落于无菌的牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行平板划线，于恒温培养箱中培养；挑取艾草内生细菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面试管中进行培养。优点是：能够从艾草叶中提取3种内生细菌，通过测试确定内生细菌具有抑菌作用，并对艾草内生细菌进行了单细胞微生物生长曲线测定、环境因素对微生物的影响、艾草菌体蛋白的提取进行了研究。

技术领域

本发明属于微生物技术及生物防治领域，尤其涉及一种艾草中拮抗菌株筛选及纯化的生产方法。

背景技术

艾草是我国常见的中草药之一，具有温经、止血、抗菌抗病毒等作用，有很高的药用价值。艾草植株的根、茎、叶都可以入药，具有温经、去湿、散寒、止血、抗菌、抗病毒等作用。也可作为食品添加剂、天然植物染料，有很大的应用前景。艾草广泛的分布于我国的东北、华北、华东、华南、西南以及陕西及甘肃等地区，具有很强的适应性能力，在道路旁荒野、草地普遍存在。艾草还具有耐风蚀、耐高温、抗严寒、较高的生物量、根系粗壮、木质化、水平根系发达等特点，是一种优良的水土保持植物，对生态环境的保护和恢复起到非常重要的作用。

植物内生细菌分布于植物的不同组织中，有充足的营养物质，同时受到植物组织的保护作用，不受外部恶劣环境如强烈日光、紫外线、风雨等的影响具有稳定的生态环境，相对于腐生细菌更易于发挥生防作用。内生细菌与植物长期地生活在一起，其细胞膜特性不同于腐生细菌，对植物产生的抗菌毒性物质有了耐性，相对于其它细菌作为生防菌更具有竞争性，可以经受住植物防卫反应的作用。内生细菌与病菌可以直接相互作用，可以作为外源基因的载体。

目前还没有从野生艾草叶片中分离出的内生细菌的相关研究，而艾草内生细菌具有很好的抑菌、杀菌作用，制备的方法简便、易操作，具有很大的应用前景。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种艾草中拮抗菌株筛选及纯化的生产方法，可对野生艾草叶片中内生细菌进行分离，并对其进行观察。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

一种艾草中拮抗菌株筛选及纯化的生产方法，包括以下步骤：

1)超声波提取制备艾草提取液：

称取25-35g的干野生艾草叶，用粉碎机将其粉碎成粉末，装于500ml烧杯中，加入290-310ml的75％乙醇溶液，于35-40℃超声波提取器中提取38-42min，待提取结束后将艾草提取液倒入锥形瓶中收集，密封于冰箱中保存，所述冰箱内温度在3-5℃，弃掉滤渣；

2)艾草内生细菌的制备：

艾草提取液稀释液的制备：用移液枪吸取1000μl艾草提取液于盛有9ml无菌水的试管中充分混合，更换移液枪头，从此试管中吸取1000μl溶液加入到另一个装有9ml无菌水的试管中，混合充分，以此类推配制10种不同稀释梯度的艾草提取液稀释液；

在无菌的操作下，将无菌的牛肉膏蛋白胨培养基倒入平板中，待牛肉膏蛋白胨培养基凝固后，用移液枪分别吸取100μl不同稀释梯度的艾草提取液稀释液于平板中进行涂布，并将平板放置于35-39℃的恒温培养箱中培养28-32h；

3)艾草内生细菌的分离、纯化：

在无菌操作下，用接种环挑取步骤2)得到的无污染的艾草内生细菌单菌落于无菌的牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行平板划线，进行初步的分离纯化；划线完毕后，将培养基倒置于35-39℃恒温培养箱中培养28-32h；

将培养好的艾草内生细菌取出，挑取无污染的艾草内生细菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面试管中进行培养；