[发明专利]产D-色氨酸的工程菌及构建方法及生产D-色氨酸的用途

说明书

本发明公开了一种产D‑色氨酸的工程菌及构建方法及生产D‑色氨酸的用途，构建方法为：将酰化氨基酸消旋酶突变基因和N‑乙酰‑D‑氨基酸酰基水解酶突变基因转入到大肠杆菌中，构建得到产D‑色氨酸的工程菌，本发明优化了N‑乙酰‑D‑氨基酸酰基水解酶突变基因和酰化氨基酸消旋酶突变基因，提高了N‑乙酰‑D‑氨基酸酰基水解酶对N‑乙酰‑D‑色氨酸的酰基水解活性和酰化氨基酸消旋酶对N‑乙酰‑L色氨酸的消旋活性，提高了D‑色氨酸的产量以及产品品质。并且将两种酶在同一个工程菌种表达，节省了发酵成本，简化了生产工艺。

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种产D-色氨酸的工程菌及构建方法及生产D-色氨酸的用途。

背景技术

D-色氨酸作为一种非蛋白光学活性氨基酸，具有特殊的生理学性质，在食品、饲料工业以及农业中均有一定的价值，可以作为非营养性甜味剂、饲料添加剂和植物生长剂，特别是在医药行业中，D-色氨酸是抗癌剂和免疫抑制剂的重要合成前体。D-色氨酸是他达那非--治疗男性勃起功能障碍(ED)药物的原料。其化学名称是D-α-氨基-β-吲哚基丙酮酸。

现有的D-色氨酸的制备方法包括膜拆分法，氨基酰化酶拆分法，酶降解法，酰胺酶法，海因酶法。其中氨基酰化酶拆分法工艺简单，收率高，产物光学纯度较高，具有较好的工业价值。在氨基酰化酶拆分法中，N-乙酰-DL-色氨酸中的N-乙酰-D-色氨酸被D-氨基酰化酶水解为D-色氨酸，如果不能将剩余的N-乙酰-L-色氨酸进行利用的话，工艺的理论最高收率只有50％。N-乙酰-L-色氨酸可以通过化学消旋的方法生成N-乙酰-DL-色氨酸再次利用，但由于N-乙酰-L-色氨酸化学性质不稳定，容易被氧化，化学消旋过程会生成大量的副产物，带来较多的物料损失，所得到N-乙酰-DL-色氨酸的质量也难以达到再次利用的要求。N-乙酰-氨基酸消旋酶是专一地将N-乙酰-氨基酸消旋化的酶，通过N-乙酰-氨基酸消旋酶的酶消旋过程代替化学消旋过程，可以高效地将N-乙酰-L-色氨酸转化为N-乙酰-DL-色氨酸，但由于自然界中此酶的活性较低，目前此酶还难以应用到生产中。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种产量大，低成本的产D-色氨酸的工程菌。

本发明的第二个目的是提供一种产D-色氨酸的工程菌的构建方法。

本发明的第三个目的是提供一种产D-色氨酸的工程菌发酵生产D-色氨酸的用途。

本发明的技术方案概述如下：

产D-色氨酸的工程菌的构建方法，包括如下步骤：将酰化氨基酸消旋酶突变基因和N-乙酰-D-氨基酸酰基水解酶突变基因转入到大肠杆菌中，构建得到产D-色氨酸的工程菌，所述酰化氨基酸消旋酶突变基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示，所述N-乙酰-D-氨基酸酰基水解酶突变基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.2所示。

上述方法构建的产D-色氨酸的工程菌。

上述产D-色氨酸的工程菌发酵生产D-色氨酸的用途。

本发明的优点：

本发明优化了N-乙酰-D-氨基酸酰基水解酶突变基因和酰化氨基酸消旋酶突变基因，提高了N-乙酰-D-氨基酸酰基水解酶对N-乙酰-D-色氨酸的酰基水解活性和酰化氨基酸消旋酶对N-乙酰-L色氨酸的消旋活性，提高了D-色氨酸的产量以及产品品质。并且将两种酶在同一个工程菌种表达，节省了发酵成本，简化了生产工艺。

附图说明

图1为D-色氨酸手性色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

T4 DNA连接酶购自NEW ENGLAND BioLabs，

实施例1