[发明专利]一种芽孢杆菌的流加补料发酵方法

说明书

本发明公开了属于微生物发酵技术领域的一种芽孢杆菌的流加补料发酵方法。芽孢杆菌经一、二级种子扩大培养后接入发酵培养基中培养，期间通过补料流加碳源和基础培养基中相对缺乏的甘氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苏氨酸、脯氨酸的混合物经喷雾干燥得到的每克菌粉芽孢杆菌CFU不少于1.0×10¹¹个，显著提高单位产量，降低了单位成本。枯草芽孢杆菌ANSB471用于降解呕吐毒素，反应48h后，呕吐毒素降解率达到95％。

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种芽孢杆菌的流加补料发酵方法。

背景技术

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)又名脱氧瓜萎镰刀菌烯醇或呕吐毒素，呕吐毒素(DON)对谷物的污染居于镰刀菌毒素之首，严重威胁人和家畜的健康。小麦、玉米等谷物及其副产品均易感染呕吐毒素，加拿大、北欧地区、美国等国外地区发生率比较高，我国从南到北均可发生。有研究表明，在我国食管癌和胃癌高发地区居民饮食中呕吐毒素污染率和含量均相当高。1998年，国际癌症研究机构(IARC)公布评价报告中，把呕吐毒素列为三类致癌物之一。寻求一种能够有效地控制和解决粮食、饲料中呕吐毒素污染的方法，才能很好地提高我国畜牧业经济效益和改善食品安全水平。传统的理化方法去毒都存在一些问题，如去毒效率低，导致粮食饲料中的营养损失，影响粮食、饲料感官品质，有些方法所需要的设备价格昂贵等等，从而限制了实际生产中的应用。

申请公布号为CN103243047A的发明专利公开了一株高效降解呕吐毒素的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ANSB471(保藏编号CGMCC No.7344)。并公开其培养方法为，取活菌浓度为10⁹CFU/ml的枯草芽孢杆菌ANSB471 0.5-2.5ml，接种于50-100ml培养基中，在30-40℃进行摇瓶发酵培养16-24h，转速180-220r/min，pH值7.0-7.4。取枯草芽孢杆菌的发酵液900μl，加入100μg/ml的呕吐毒素100μl，将反应体系的pH值调节为7.2，在37℃反应48h，枯草芽孢杆菌ANSB471对呕吐毒素的降解率达到80％。

申请公开号为CN104232526A的发明专利公开了一种枯草芽孢杆菌活菌制剂的制备工艺，枯草芽孢杆菌ANSB471活菌制备工艺需要同时兼顾活菌数和呕吐毒素降解活性，CN104232526A中提供的发酵方法不能满足枯草芽孢杆菌ANSB01G发挥最佳的呕吐毒素降解特性。

发明内容

本发明为了解决上述技术问题，提出一种芽孢杆菌的流加补料发酵方法。具体技术方案如下：

一种芽孢杆菌的流加补料发酵方法，包括如下步骤：

(1)一级种子制备：取芽孢杆菌活菌菌种悬浊液接种于一级种子培养基中，然后进行培养；

(2)二级种子制备：将一级种子接种于二级种子培养基中，然后进行培养；

(3)发酵：将二级种子接种于发酵培养基中，然后进行发酵培养；

当发酵至8-10h时流加补料培养基A，发酵至12-16h时流加补料培养基B；

所述补料培养基A包含质量百分比5％-15％的碳源；

所述补料培养基B包含质量百分比5％-10％的碳源和质量百分比2.1％-11％发酵培养基中缺乏的菌种限制性氨基酸。

所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌。

所述一级种子培养基包括的原料为：每1000mL，胰蛋白胨8-12g、酵母浸膏1.5-3g、葡萄糖1.5-4g、牛肉膏2-5g、氯化钠3-6g、磷酸氢二钠2.5-4g、七水硫酸镁0.5-1.5g，蒸馏水1000mL，pH为7.0-7.4。