[发明专利]一种高效低毒的质粒DNA转染方法

说明书

本发明公开了一种高效低毒的质粒DNA转染方法，属于生物技术领域。本发明方法包括如下步骤：(1)以20％‑30％的细胞密度接种细胞，进行培养；(2)当细胞密度生长至40％‑60％时，进行传代培养；(3)待传代培养的细胞处于刚贴壁未伸展状态时，用质粒‑转染剂混合物转染细胞。本发明提高了细胞转染效率，同时对细胞毒性较小，不需要额外的设备或者试剂，方便操作和掌握，易于推广。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种转染效率高、细胞毒性低的改良型质粒DNA转染方法。

背景技术

分子生物学及细胞生物学研究领域中细胞转染是必不可少的一项技术。细胞转染常用的方法主要分为三类：物理转染方法、化学转染方法和生物转染方法。物理转染方法包括电穿孔法、显微注射法等。化学转染方法包括脂质体转染法、磷酸钙共沉淀法等。生物介导的转染方法包括病毒介导转染等。理想的转染方法应该具有转染效率高、细胞毒性低且方便易操作的特点。物理转染方法技术敏感性高，但需要单独购买设备，而且一般对细胞的活力影响都比较大。病毒转染方法的转染效率较高，但操作步骤复杂，有一定的的生物安全风险，可能对操作人员有影响，尚不是理想的转染方法。目前实验室常用的转染方法为化学转染方法，且以脂质体转染法最为常用。商品化的脂质体转染试剂易于购买和使用。在HeLa、HEK 293、NIH/3T3等细胞中，脂质体转染方法的转染效率较高且具有低细胞毒性的特点，但对于难转细胞来说，脂质体转染方法的转染效率并不令人满意，这限制了脂质体转染方法的使用。

脂质体转染方法在具体操作中分为两种不同操作方法，一种是正向转染方法，一种是反向转染方法。大多数公司所提供的操作指南都采用正向转染方法。正向转染方法是指在转染前24小时，将待转染的细胞接种于细胞培养平板中并确保在转染前细胞密度达到80％-90％。转染时，质粒与转染试剂按公司所提供的配比混合好后孵育一段时间，然后直接加入待转染细胞的培养基中。在难转细胞中，正向转染的方法往往效率不高。反向转染方法与正向转染方法的不同在于待转染细胞不需要提前24小时接种，转染前先将质粒与转染试剂按公司所提供的配比混合好后孵育，同时将贴壁细胞消化，然后把质粒与转染剂混和物与消化起来的悬浮状态的细胞一起接种到培养板中。反向转染法具有操作方便，可实现自动化操作的特点，常被高通量筛选所采用。然而，通过反向转染方法介导质粒转染细胞时，对细胞往往有明显的毒性，这也限制了反向转染方法的使用。由此看来，开发一种转染效率高、细胞毒性低且方便操作的转染方法非常必要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种转染效率高、细胞毒性低的改良型质粒DNA转染方法。

本发明基于如下原理：细胞内和细胞外具有很多阻碍质粒DNA进入细胞并高效表达的障碍。质粒-转染剂复合物进入细胞中首先要通过细胞膜屏障，这一过程主要由内吞作用介导，细胞膜张力对内吞作用具有很大的影响，低细胞膜张力可以促进内吞作用。细胞在传代后贴壁伸展过程中，细胞膜张力降低，有利于促进质粒进入细胞，提高外源基因的表达效果。另外，质粒必须还要进入细胞核才能转录mRNA，并表达相应的蛋白。在细胞分裂过程中核膜暂时性解体，可使质粒容易进入细胞核。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种高效低毒的质粒DNA转染方法，包括如下步骤：

(1)以20％-30％的细胞密度接种细胞，进行培养；

(2)当细胞密度生长至40％-60％时，用胰蛋白酶消化细胞，进行传代培养；

(3)待传代培养的细胞处于刚贴壁未伸展状态时，用质粒-转染剂混合物转染细胞。

优选的，当转染CAL 27细胞时，所述方法包括如下步骤：

(1)转染24小时前将CAL 27细胞按20％-30％的密度接种到细胞培养板，加入培养基培养；