[发明专利]一种重组果胶甲酯酶pmeA及其编码基因与应用

说明书

本发明公开了一种重组果胶甲酯酶pmeA及其编码基因与应用。本发明是根据GenBank上已公布的黑曲霉pmeA的氨基酸序列，然后根据宿主菌的密码子偏好性，对密码子进行优化，从而得到了pmeA基因的新的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其表达的重组果胶甲酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。pmeA基因与pCuGAPGαAL表达载体连接后，将重组质粒pCuGAPGαAL‑pmeA整合到产朊假丝酵母基因组中，实现了pmeA基因的异源表达。该重组果胶甲酯酶可以高效催化果胶中的甲氧基水解，降低果胶酯化度，可用于食品、医药和化工行业的生产中。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及重组果胶甲酯酶及其应用。

背景技术

果胶在植物中的含量比较丰富，主要以高甲氧基果胶形式存在。对于低甲氧基果胶，可供提取的天然植物很少，迄今为止国内外报道最多的就是在向日葵中提取到了低甲氧基果胶。但是向日葵种植面积小，且受温度、季节的影响，不利于低酯果胶的商业发展。

目前生产低酯产果胶的方法有：酸法、浓氨水法、碱法和果胶甲酯酶酶解法。前两种方法的缺点是反应缓慢；碱法降酯速度快，但是会破坏果胶的聚合度；果胶甲酯酶可以迅速的将果胶分子进行去甲基化反应，可以达到将高甲氧基果胶转化为低甲氧基果胶的目的，由此酶法生产低甲氧基果胶亟需规模化。

高酯果胶在pH3.0～5.0，可溶性固形物55％时才能形成凝胶，而低酯果胶只要有微量的Ca²⁺等金属离子存在时，在较宽的pH范围内都可以形成果胶。低酯果胶满足了人们对低糖、低热量、低甜度食品的要求，被消费者认为是高质量的产品，是很好的食品稳定剂、胶凝剂或增稠剂。

目前通过基因工程技术生产酶制剂已成为工业酶的主导。果胶甲酯酶(Pectinmethylesterase，PME)属于碳水化合物酯酶第8家族的羧酸酯酶，对甲酯化程度较高的果胶有最高酶活，其方式是通过使同型半乳糖醛酸寡聚糖主链上半乳糖醛酸的C-6基上的甲氧基发生去酯化作用，释放出游离羧基端和甲醇，重塑了果胶的结构，对果胶后续的解聚反应和凝胶的形成有很大的影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种果胶甲酯酶编码基因、含有该基因的表达载体和异源表达该重组果胶甲酯酶的工程菌。

本发明的另一目的提供上述重组果胶甲酯酶的应用。

本发明通过基因工程技术得到了一种新的果胶甲酯酶基因，并将其进行重组表达，得到的重组果胶甲酯酶。

本发明首先取得GenBank上已公布的黑曲霉pmeA的氨基酸序列，然后根据产朊假丝酵母的密码子偏好性，对其密码子进行优化，从而得到了pmeA基因的新的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其结构基因全长996bp，包含信号肽序列。

本发明所述的果胶甲酯酶基因pmeA表达的重组果胶甲酯酶的氨基酸序列如SEQID NO.2所示，包含331个氨基酸，理论分子量为36.41kDa。

重组果胶甲酯酶的表达方法，包括以下步骤：

(1)根据宿主菌的密码子偏好性，对获得的pmeA基因的密码子进行优化，从而到了pmeA基因的新的核苷酸序列；

(2)优化后的pmeA基因与表达载体pCuGAPGαAL连接，构建重组质粒pCuGAPGαAL-pmeA；

(3)重组质粒pCuGAPGαAL-pmeA转化大肠杆菌，筛选出阳性克隆；

(4)重组质粒pCuGAPGαAL-pmeA转化产朊假丝酵母，筛选阳性克隆，活化后保种，得到C.U-pmeA重组菌；

(5)比较筛选到的几株重组菌的果胶甲酯酶酶活，从中筛选酶活最高的一株；

(6)重组菌C.U-pmeA高密度培养，分离上清，即为重组果胶甲酯酶粗酶液。