[发明专利]一种固氮菌株及其微生态制剂

说明书

本发明公开了一种适应高海拔低温型自身固氮菌株为暗灰链霉菌株。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.14766，命名为暗灰链霉菌HG101菌株(Streptomyces canus HG101)。

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种适应高海拔低温型自身固氮菌株(Streptomyces canus CGMCC NO.14766)及基于该固氮菌株制备微生态制剂的发酵方法。

背景技术

现在人类生产氮肥使用的化学方法，不仅需要高温、高压等非常苛刻的条件，而且还浪费大量原料，氮分子的有效利用率很低。固氮菌每年从空气中约固定1.5亿吨氮肥，是全世界生产氮肥总量的几倍。因此，固氮菌及其固氮酶的研究已成为当今农业生产应用和科学研究的热点。生物固氮是固氮微生物的一种特殊的生理功能，已知具固氮作用的微生物约近50个属，包括细菌、放线菌和蓝细菌，它们的生活方式、固氮作用类型有较大区别，但细胞内都具有固氮酶。不同固氮微生物的固氮酶均由钼铁蛋白和铁蛋白组成。固氮酶必须在厌氧条件下，即在低的氧化还原条件下才能催化反应。根据固氮微生物与高等植物的关系，可分为自生固氮菌、共生固氮菌以及联合固氮菌。

共生固氮菌，在与植物共生的情况下才能固氮或才能有效地固氮，固氮产物氨可直接为共生体提供氮源。主要有根瘤菌属(Rhizobium)的细菌与豆科植物共生形成的根瘤共生体，弗氏菌属(Frankia,一种放线菌)与非豆科植物共生形成的根瘤共生体；某些蓝细菌与植物共生形成的共生体，如念珠藻或鱼腥藻与裸子植物苏铁共生形成苏铁共生体，红萍与鱼腥藻形成的红萍共生体等。根瘤菌生活在土壤中，以动植物残体为养料，同时，根瘤菌从空气中吸收氮气转化为氨，被豆科植物利用，根瘤菌与豆科植物形成共生关系，因此根瘤菌也被称为共生固氮菌或者联合固氮菌。

联合固氮菌，有的固氮菌生活在某些植物根的粘质鞘套内或皮层细胞间，不形成根瘤，但有较强的专一性，如雀稗固氮菌与点状雀稗联合，生活在雀稗根的粘质鞘套内固氮；其他如生活在水稻、甘蔗及许多热带牧草的根际的微生物，由于与这些植物根系联合，因而都有很强的固氮作用。

自生固氮菌(Azotobacteria)是自由生活在土壤或水域中，能独立进行固氮作用的某些细菌。以分子态氮为氮素营养，将其还原为NH₃，再合成氨基酸、蛋白质。包括好氧性细菌，如固氮菌属、固氮螺菌属以及少数自养菌；兼性厌氧菌，如克雷伯氏菌属；厌氧菌，如梭状芽孢杆菌属的一些种。还有光合细菌如红螺菌属、绿菌属以及蓝细菌，如鱼腥藻属、念珠藻属等。自生固氮菌中，人们应用得最多的是圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)。圆褐固氮菌具有较强的固氮能力，并且能够分泌生长素，促进植株的生长和果实的发育,因此，将圆褐固氮菌制成菌剂，施用到土壤中，可以提高农作物的产量。

国内外关于固氮菌及固氮酶文献报道很多，也有一些相关的专利申请和专利授权，相关报道和这里主要集中在根瘤菌属。根据农业部2012版生物有机肥执行标准，在原有有机肥标准基础上，增加了“功能性菌株活菌数”，和“保质期”两项指标。具体为有效活菌数(cfu)≥0.20亿/g。有效期≥6月。目前固氮菌肥基本上是添加共生固氮菌或联合固氮菌的生物菌剂，根瘤菌菌剂为主。添加自身固氮菌的生物有机肥很少。作为根瘤菌添加剂，在有机肥商品中也存在“货架期极短”致命缺陷。根瘤菌最适生长温度26— 30℃，无芽孢，人工培养条件下细胞数可达10—100亿个/mL，由于无芽孢，人工培养条件下菌体极易死亡，失去活性。4℃斜面保存1个月后，死亡率95％，3个月基本接种不出菌种。在根瘤菌生产过程中，根瘤菌在微滤，超滤浓缩工艺过程中，活菌死亡率超过90％以上，经干燥后(不论冻干还是吸附自然干燥)，活菌数损失非常大，存活率不及原有的 1％，严重影响根瘤菌作为商品的货架期，很难满足6个月的保质期要求。

发明内容

本发明旨在针对当前固氮菌生产与应用方面的不足，提供一种适应高海拔低温型自身固氮菌及其生产工艺方法，包括固氮菌菌株的筛选，发酵培养基的选择，发酵工艺的优化，固氮菌微生态制剂制备，固氮菌微生态菌剂的应用。