[发明专利]一种无血清驯化培养人间充质干细胞的方法

说明书

本发明公开了一种无血清驯化培养人间充质干细胞的方法。该方法使人胎盘来源的间充质干细胞适应至体外的无血清培养体系，并获得了与有血清培养相似的细胞密度和活率，与现有的人间充质干细胞培养方法相比，更经济、更有效。采用此方法，与血管生长相关的bFGF、PDGF、VEGF表达量比未驯化细胞有所上升。驯化后的细胞可以用于静脉注射的干细胞制剂制备；所驯化细胞的分泌活性因子成分可用作面膜、眼膜、发膜的组分。

技术领域

本发明涉及一种人间充质干细胞的培养方法，更具体地说，本发明涉及利用一种独特、安全的驯化培养方式达到人间充质干细胞的无血清体外培养。

背景技术

干细胞是人体细胞的祖先，我们体内的所有细胞均来自于干细胞。当体内的细胞衰老死亡或者损伤变性时，干细胞就会生长和转变出可以替代它们的细胞。作为种子细胞,临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。人间充质干细胞（human mesenchymal stemcells, HMSC）是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。最初的临床研究是1995年由Lazarus等人进行的，他们收集缓解期血液肿瘤患者的自体MSC，在体外扩增培养4~7周，然后再静脉注射入患者体内，患者被分为3组，分别给予不同剂量的MSC，注射后没有观察到毒副作用，提示MSC用于移植治疗安全可靠。随后自体MSC的临床报道逐渐增多，病种涉及放疗及化疗后造血重建、移植物抗宿主病（GVHD）、心脏系统疾病等，在这些报道中均证明临床经静脉输注安全可靠。间充质干细胞的体外培养工艺是关系到干细胞作为药物或者美容产品使用安全性的关键步骤。培养工艺中尤其是培养基的成分是主要的影响参数。现在普遍采用的培养方法有常规的加牛血清的培养方法和无血清培养方法两种。血清培养的方法较为简单，细胞生长状态较好，主要质控对象是血清，但因为加入的血清比例在10-20%之间，存在较大的牛血清蛋白残留的问题。在检索到的专利（包括授权和公开未授权）中，间充质干细胞的培养主要采用DMEM的完全培养基。专利C12N5/0775(2006.01)I提到一种扩增未分化的间充质干细胞(MSC)的方法，其包括：在包含烟酰胺和成纤维细胞生长因子4(FGF4)的培养基中培养未分化的MSC，其中所述培养基没有另外添加其它生长因子和/或分化因子，从而产生未分化的MSC扩增细胞。无血清培养基虽然成分清晰，但是成本高昂，而且存在干细胞的生长状况不理想等的问题。因此，亟待改进干细胞体外培养的方法，在保障安全性的同时，使细胞获得良好的生长状态，同时还可以降低培养的经济成本。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种独特的培养方法，为人间充质干细胞的体外培养提供一种无血清驯化的方法。本发明的目的通过下述技术方案予以实现。*除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数。

本发明提供了一种体外培养的方法，其特征在于，该方法使用新鲜的无血清基础培养基，按照一定的比例添加并置换体外人间充质干细胞的有血清完全培养液，利用间充质干细胞自身在培养过程中分泌的外泌体和微囊成分作为补充，使间充质干细胞完成无血清培养的驯化，最终实现无血清培养体系。驯化后的间充质干细胞的密度及活率、细胞表面的主要标志物与有血清培养基无明显差异，检测培养液及外泌体所分泌的细胞因子的组分和丰度发现，与血管生长相关的bFGF、PDGF、VEGF表达量比未驯化细胞有所上升，表1。收获的细胞可以用于静脉输注，收获的培养上清、外泌体和微囊成分可以用于美容产品的制备。

表1：无血清驯化培养的人间充质干细胞各项指标