[发明专利]一种检测结核抗体的多重液相芯片

说明书

本发明公开了一种检测结核抗体的多重液相芯片，包括抗原藕联编码微球和生物素化抗体，所述抗原藕联编码微球为将LAM、CFP‑10、EAST‑6、16KD、38KD、65KD和TBGL抗原、CFP10‑EAST6和38KD‑16KD融合蛋白、鸡IgG、Biotin‑BSA、BSA、SA‑PE分别偶联在不同编码的荧光微球上；所述生物素化抗体为用羧基活性的生物素标记兔抗鸡IgG和山羊抗人IgG。本发明建立了65KD、CFP10‑EAST6和38KD‑16KD多重检测体系，结果表明，此多重体系能有效区分确诊结核病人和非结核病人（P<0.05），阳性率为88.73%，明显高于T‑SPOT、TB‑DOT、TB‑CHECK‑1和赛普克（51.2%、50.2%、39.4%和65.7%)这四种试剂盒的检测结果。通过半年的临床实验表明该体系稳定性好、特异性好、灵敏度高、重复性好，检测时间快，初步显示出所建立的多重检测体系的优势。

技术领域

本发明涉及一种液相诊断芯片，具体为一种检测结核抗体的多重液相芯片。

背景技术

全球经济化的发展、贸易的开通，交通的便捷，无不为各国旅行、探亲、交易打开了方便之门，人口流动速度加快，与此同时传染病的传播也随之蔓延^[2]。近年来结核病在全球范围内又死灰复燃,严重威胁着人类健康,已成为最严重的公共卫生问题之一。传染性肺结核，是目前《中华人民共和国国境卫生检疫法实施细则》中明确规定禁止入境的唯一的一种疾病。调查显示肺结核病疫情在全球范围内明显回升的一个主要原因是全球经济交流和移民人群的增多，因此世界卫生组织呼吁主要移民输出国及输入国需要加强出入境或移民申请者的肺结核筛查工作^[3]。

目前临床上常用方法为结核菌集菌涂片法、BD培养法、罗氏培养法，但是上述方法各有其自身的优缺点。直接涂片法适合于各类标本，操作简便、快速、价格低廉，适合于各级实验室开展，但其灵敏度低，通常每毫升含5000-10000条以上抗酸染色才能使阳性结果。培养法是结核病诊断的金标准，但由于检测时间需1-2个月，快速培养法虽然比传统的落实培养法缩短了许多，但也需平均18天，阴性确认仍需6周，远远不能达到结核病早期诊断的要求。近年来开展的RNA恒温扩增实施检测技术(SAT)虽然缩短了检测周期，但其要求的样本是患者的痰液，在口岸筛查过程中很难得到符合要求的检测样本。因此目前口岸的结核筛查工作还停留在X线进行影像学检查阶段。

近二十年来，很多学者都致力于用免疫学的方法来检测结核的血清抗体作为结核病筛查的辅助手段，研究证明这一方法确切可行，并大大提高了涂片、X线等方法的灵敏度，本课题组在过去的十年里也对常用的结核抗原进行了筛查，并确定了灵敏度较高的几种抗原，但前期的研究表明，当不同的抗原混合在一个ELISA平板内时，其不同抗原的含量、相互影响等因素将影响检测结果的准确性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的ELISA法检测结核病时会出现不同的抗原混合在一个ELISA平板内时，其不同抗原的含量、相互影响等因素将影响检测结果的准确性的缺陷，提供一种检测结核抗体的多重液相芯片。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种检测结核抗体的多重液相芯片，包括抗原藕联编码微球和生物素化抗体，所述抗原藕联编码微球为将LAM、CFP-10、EAST-6、16KD、38KD、65KD和TBGL抗原、CFP10-EAST6和38KD-16KD融合蛋白、鸡IgG、Biotin-BSA、BSA、SA-PE分别偶联在不同编码的荧光微球上；所述生物素化抗体为用羧基活性的生物素标记兔抗鸡IgG和山羊抗人IgG。

进一步的，所述荧光微球在偶联前采用EDC和S-NHS进行活化。

进一步的，生物素化抗体的制备方法为：

(1)取出待标记的生物素，平衡至室温；

(2)称取生物素1mg，溶于200μL超纯水，配制成5mg/mL的1液；