[发明专利]可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法

说明书

本发明提供了一种可支持人源饲养层细胞可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，包括以下步骤：S1、将人骨髓间充质干细胞置于培养基中进行传代培养；S2、将含有潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染S1中传代培养的人骨髓间充质干细胞，得到人骨髓间充质干细胞；S3、将含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染人骨髓间充质干细胞，得到TW2R细胞；S4、将含有E‑cadherin基因和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒颗粒染入TW2R细胞，得到TWE3R细胞。本发明制得的人源饲养层细胞可稳定表达E‑cadherin蛋白，而且稳定表达E‑cadherin基因后不会影响TWE3R细胞的增殖能力。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法。

背景技术

人胚胎干细胞在转化医学、再生医学以及新药筛选方面有着广阔的运用应用前景，而目前人胚胎干细胞(hESC)的培养，一般都需要小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞，但是使用这些动物源性材料会给今后临床运用带来一定的生物安全问题。此外，由于一般只能用5代之内MEF作为饲养层来培养人胚胎干细胞，而不同批次胎鼠来源的MEF之间存在差异，维持人胚胎干细胞多能性生长的能力也不一样，这些都会给人胚胎干细胞的体外长期培养带来不稳定性。虽然加拿大著名的STEMCELL公司最近研发的TeSR^TM-E8^TM是一种成分高度确定、无需饲养层细胞(feeder-free)的培养基，适用于人胚胎干细胞的培养，尽管TeSR-E8培养基能够在没有动物蛋白的情况下支持干细胞的生长，但其中添加了人血清白蛋白和人源基质蛋白，这就使得培养条件极其昂贵，不适合常规使用。因此，研究和开发可支持人胚胎干细胞生长的永生化人源性饲养层细胞对于今后人胚胎干细胞运用于临床有着重要意义。

E-cadherin(钙黏着素E)是钙依赖性黏附分子的亚族成员，是一种跨膜蛋白，广泛分布在非神经上皮组织，它与细胞内的特异性分子结合，参与同种亲和性的细胞-细胞间的黏附，胚胎发育以及正常组织中上皮细胞层的形成和维持。此外有研究显示在维持胚胎干细胞的多能性方面，E-cadherin也起着重要作用。

发明内容

本发明的一个目的是解决上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，制得的人源饲养层细胞可稳定转染E-cadherin基因从而稳定表达E-cadherin蛋白，而且稳定表达E-cadherin基因后不会影响TWE3R细胞的增殖能力。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，包括以下步骤：

S1、将人骨髓间充质干细胞置于MSC培养基中进行传代培养；

S2、将含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染S1中传代培养的人骨髓间充质干细胞中，然后加入hygromycin B进行筛选，得到含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的人骨髓间充质干细胞；

S3、将含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染S2中含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的人骨髓间充质干细胞中，然后加入G418进行筛选，得到含有hTERT基因、潮霉素抗性基因、Wnt3a基因、新霉素抗性基因的TW2R细胞；

S4、将含有E-cadherin基因和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒颗粒感染S3中TW2R细胞中，然后加入puromycin进行筛选，得到过表达E-cadherin的TWE3R细胞，即为人源饲养层细胞。

优选的是，所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S1中MSC培养基为每毫升培养基中含有0.08～0.1mL的胎牛血清、0.01～0.015mL的Antibiotic-Antimycotic、0.9～1.1ng的bFGF、以及余量的DMEM。