[发明专利]改善单克隆抗体的检测结果的方法

说明书

本发明提供一种样品中的单克隆抗体的检测方法，所述方法包括以下的步骤：(a)捕捉样品中的单克隆抗体并固定化于多孔体的细孔内的步骤；(b)使固定化有该单克隆抗体的多孔体与固定化有蛋白酶的纳米颗粒接触而进行单克隆抗体的选择性蛋白酶解的步骤；及(c)通过液相色谱质谱分析(LC‑MS)来检测利用选择性蛋白酶解而得到的肽片段的步骤，在步骤(a)之后，还包括(a’)进行在酸性条件下的还原反应的步骤。根据本发明，可以期待使用了质谱分析的单克隆抗体的检测方法的进一步的应用。

技术领域

本发明涉及改善利用质谱分析进行单克隆抗体定量时的检测结果的方法。更具体而言，本发明涉及为了定量单克隆抗体而已确立的方案的改良。

背景技术

近些年，作为替代ELISA法的定量法，积极进行了使用LC-MS/MS法的抗体药物的生物催化剂的开发。

本发明人等小组发现：通过将测定对象的单克隆抗体及能将其作为底物消化的蛋白酶这两者固定化于固相，从而能够通过区域选择性的固相-固相反应而实现单克隆抗体的蛋白酶解，成功地获得了各个单克隆抗体特有的肽(专利文献1～6和非专利文献1～8)。该方法是使将单克隆抗体固定化于细孔内的多孔体、与固定化有蛋白酶的纳米颗粒在液体中接触来进行单克隆抗体的选择性蛋白酶解的质谱分析的前处理方法，是能够通过液相色谱质谱分析(LC-MS)对得到的肽片段进行有效地检测和定量的突破性技术。本发明人等将本方法命名为“纳米表面和分子取向限制蛋白质水解(nano-surface and molecular-orientation limited proteolysis)方法(nSMOL法)”。

基于nSMOL法进行的血中抗体药物的定量是如下方法：能够仅对具有抗体药物的特异性序列的Fab域限定性胰蛋白酶解、抑制在LC-MS/MS分析中视为最棘手问题的离子抑制效果，从而提供更稳定的可靠性高的定量值。本发明人等已经确认了：在15种以上的抗体药物的血药浓度测定中，组合nSMOL法和LC-MS/MS法而使用的单克隆抗体的检测方法符合日本、美国和欧洲的用于验证生物学分析方法的准则的基准。

另一方面，已知作为生物高分子的蛋白质中存在具有非常特征性的坚硬的(刚性)结构的蛋白质。例如，β淀粉样蛋白、转铁蛋白、多个跨膜型蛋白质(视紫红质、转运蛋白等)中，尽管机理不同，但已知通过采用刚性结构其作用分别得到了控制。

作为使蛋白质结构保持刚性的结构之一，有通过SS键而产生如结扣状那样的结构的半胱氨酸结结构。作为具有半胱氨酸结结构、有助于特异性信号传递的分子，可列举出血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素等细胞因子类。

抗体分子是由2根重链和2根轻链组成的4聚体高分子量蛋白质，在各自链中存在：具有抗体特异性氨基酸序列而定义抗体结构的多样性、功能的可变区；和、分子结构相同的恒定区。在可变区中，突变的频率也特别高且决定与抗原的结合性的区域是互补决定区(CDR)；另外，在重链恒定区的CH1结构域与CH2结构域之间存在被称为铰链的灵活性非常高的结构。

由于抗体分子中存在铰链，因此使抗体结合部位(抗原结合片段：Fab,fragmentantigen binding)的立体结构学的波动得以确保，利用NMR分析等进行分子动力学解析时，尽管Fc位点几乎被三维地固定，但已知Fab位点大幅波动以至无法三维地分配。在抗原发生结合时该波动收敛而变为刚性结构。

另外，在抗体分子中，在分子内和分子间存在大量SS键，具有保持各自的区域的作用。可认为：根据抗体分子本身、周围的微细结构环境，涉及SS键的硫原子的氧化还原电位不同，SS键强度也存在差异。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开WO2015/033479号

专利文献2：国际公开WO2016/194114号

专利文献3：国际公开WO2016/143224号