[发明专利]耐热逆转录酶突变体

说明书

本发明提供：一种逆转录酶突变体，其在对应于源自莫洛尼鼠白血病病毒的野生型逆转录酶的氨基酸序列的第55位的位置包含氨基酸突变，其中所述逆转录酶突变体的特征在于所述氨基酸突变为从苏氨酸取代成另一种氨基酸，并且另一种氨基酸选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸和具有极性酸性官能团侧链的氨基酸；一种编码所述突变体的核酸；一种用于产生所述突变体和编码所述突变体的核酸的方法；一种其中使用所述突变体用于合成cDNA的方法；和一种包含所述突变体的组合物和试剂盒。

技术领域

本发明涉及耐热逆转录酶突变体。此外，本发明涉及用于增加现有逆转录酶的耐热性的方法以及用于产生耐热逆转录酶突变体的方法。

背景技术

逆转录酶(RTase)通常具有RNA依赖性DNA聚合酶活性(其为从模板RNA合成cDNA的活性)和核糖核酸酶H (RNase H)活性(其为降解RNA/DNA杂交体的RNA链的活性)。

由于逆转录酶具有RNA依赖性DNA聚合酶活性，它们可用于mRNA (其直接反映在活生物体中表达的蛋白质的氨基酸序列)的测序、cDNA文库的构建、RT-PCR等。对于这些用途，经常使用由莫洛尼鼠白血病病毒或禽类成髓细胞白血病病毒产生的逆转录酶。

因此，逆转录酶具有各种用途。然而，由于模板RNA引起了各种问题。例如，在其中mRNA具有易于形成二级结构的核苷酸序列的情况下，通过使用逆转录酶从mRNA作为模板合成cDNA可能受到二级结构的阻碍。为了解决这个问题，升高逆转录反应的温度是有效的。然而，由莫洛尼鼠白血病病毒或禽类成髓细胞白血病病毒产生的逆转录酶具有差的耐热性，并且它们在抑制RNA二级结构形成的这种温度条件下失活。因此，已经提出了具有增加的耐热性的逆转录酶突变体(参见例如专利文献1-6)。

引文列表

专利文献

专利文献1：JP 4193079 A

专利文献2：WO2004/024749

专利文献3：WO2007/022045

专利文献4：WO2009/125006

专利文献5：WO2012/108672

专利文献6：WO2015/112767

发明概述

本发明要解决的问题

然而，仍然期望开发另外的耐热逆转录酶。本发明的一个目的为提供耐热逆转录酶突变体。

问题的解决办法

作为开发耐热逆转录酶突变体的深入研究的结果，本发明人出乎意料地发现，通过用选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸、具有极性酸性官能团侧链的氨基酸、具有极性碱性官能团侧链的氨基酸和具有极性羟基脂肪族侧链的氨基酸的不同氨基酸置换由莫洛尼鼠白血病病毒(下文有时称为MMLV)产生的逆转录酶的氨基酸序列中的第55位苏氨酸(其从未被突变并且认为参与环结构的稳定)，获得了具有耐热性的逆转录酶。此外，他们发现通过组合第55位的氨基酸突变与已知耐热逆转录酶的已知氨基酸突变，进一步增加了已知逆转录酶的耐热性。此外，他们发现通过组合第55位的氨基酸突变与不同的新氨基酸突变，获得了具有进一步增加的耐热性的逆转录酶。因此，完成了本发明。