[发明专利]枯草杆菌酶细胞毒素B亚基突变体

说明书

提供了一种突变型枯草杆菌酶细胞毒素B亚基蛋白，其能够结合具有α2‑3‑连接的N‑羟乙酰神经氨酸的聚糖和具有α2‑6‑连接的N‑羟乙酰神经氨酸的聚糖。突变SubB蛋白缺失一个或多个氨基酸序列TTSTE，并且具有先前未描述的结合具有α2‑6‑连接的N‑羟乙酰神经氨酸的聚糖的能力，同时不丧失结合具有α2‑3‑连接的N‑羟乙酰神经氨酸的聚糖的能力。

技术领域

本发明涉及细菌毒素蛋白。更具体地，本发明涉及突变型枯草杆菌酶细胞毒素B亚基蛋白，其在保留结合α2-3-连接的N-羟乙酰神经氨酸能力的同时，具有结合α2-6-连接的N-羟乙酰神经氨酸的能力。

背景技术

AB5毒素在两步过程中发挥它们的作用：(i)五聚体B亚基与靶细胞表面上的特异性聚糖受体结合；(ii)AB5毒素内化，随后A亚基介导必需宿主功能的抑制或破坏¹。AB5毒素的B亚基识别细胞表面聚糖受体，指导全毒素的内化和细胞内运输。这些蛋白-聚糖相互作用的特异性对于发病机理是关键的，因为它决定了宿主易感性和组织向性。此外，AB5毒素B亚基和它们的同源聚糖之间的五价相互作用导致非常高的亲和力结合，使它们成为用于聚糖检测的有力配体，值得注意的实例是使用霍乱毒素B亚基检测组织病理学切片中的神经节苷脂GM1²和用于标记膜中的脂筏³。

2004年Paton等人描述了一个新的细菌AB5毒素亚族的发现和初步生物学特征，其原型称为枯草杆菌酶细胞毒素(SubAB)⁴。在SubAB的情况下，发现A亚基(subA)是枯草杆菌酶家族丝氨酸蛋白酶，对必需的内质网伴侣BiP/GRP78具有精细的特异性⁵。结构研究显示，与大多数枯草杆菌酶不同，SubA具有异常深的活性位点裂缝，解释了其精巧的底物特异性⁵。SubA已被证明是检查BiP在各种细胞过程中的作用的有力工具，并且它还具有作为癌症治疗剂的潜力^6，7。值得注意的是，聚糖阵列分析显示毒素的B亚基(SubB)对终止于α2-3-连接的N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)(一种人类不能合成的唾液酸)的聚糖具有高度结合特异性⁸。在阵列上的所有聚糖中，与Neu5Gcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ-产生最佳结合。如果Neu5Gc变为Neu5Ac，标记的毒素与阵列的结合减少20倍；如果Neu5Gc连接由α2-3变为α2-6，结合减少超过30倍；如果除去唾液酸，则结合减少100倍。与阵列上所示结构结合的总体模式表明，SubB对末端α2-3-连接的Neu5Gc具有高亲和力，对倒数第二部分的识别很少。SubB-Neu5Gc复合物的晶体结构揭示了这种特异性的基础。将Neu5Gc与Neu5Ac区分开的N-乙酰基部分的甲基上的另外的羟基与SubB的Tyr78^OH相互作用，同时氢键与Met10的主链相互作用⁸。Neu5Ac不会发生这些关键的相互作用，因此解释了标记的Neu5Gc的偏好性。根据结构数据，在预测的结合口袋中诱变关键残基，这样消除了聚糖识别、细胞结合和毒性。SubB氨基酸S12和Y78与Neu5Gc形成关键的稳定键⁸。S12A突变完全消除了聚糖结合，而防止与将Neu5Gc与Neu5Ac区分开的C¹¹OH基团的相互作用的Y78F突变将聚糖结合降低了90％、并且消除了突变型SubB蛋白对Neu5Gc的偏好性优于Neu5Ac⁸。