[发明专利]用磁性颗粒分离高纯度核酸的方法

说明书

本发明的主题是一种从样品溶液分离核酸的方法，其中从样品溶液分离核酸是通过吸附到磁性颗粒，然后通过施加磁场从样品溶液中分离具有吸附于其上的核酸的磁性颗粒，接着进行至少一个洗涤步骤(w)，包括：(w1)将具有吸附于其上的核酸的磁性颗粒悬浮于洗涤液中，其是水性溶液，其具有小于100mM的总盐浓度且不含有机溶剂，(w2)在洗涤溶液中孵育具有吸附于其上的核酸的磁性颗粒，和(w3)从洗涤溶液分离具有吸附于其上的核酸的磁性颗粒。本发明还涉及使用水性溶液，其具有小于100mM的总盐浓度且不含有机溶剂，作为用于洗涤具有吸附于其上的核酸的磁性颗粒的洗涤溶液。

本发明涉及从样品溶液分离核酸的方法，其中从样品溶液分离核酸是通过吸附到磁性颗粒，然后通过施加磁场从样品溶液中分离具有吸附于其上的核酸的磁性颗粒。本发明的主题也可以是在这些方法中洗涤缓冲液的用途。

背景技术

由于DNA或RNA典型存在的复杂系统，获得含有对于分子生物学应用而言足够少的污染物的DNA或RNA相当困难。这些系统例如生物样品，如组织，来自体液例如血液的细胞，培养的细胞或人工系统例如琼脂糖凝胶或PCR反应样品，通常包含相当数量的污染物，在用于分子生物学过程之前，感兴趣的DNA或RNA必须与其分离。

从细胞获得DNA或RNA的常规方案利用将细胞悬浮在溶液中，用酶和/或化学物质裂解细胞，然后将细胞中所含的核酸释放入得到的裂解物溶液。为了分离RNA，常规的用于释放DNA的裂解和溶解过程包括额外的抑制核糖核酸酶和将污染物(包括DNA)与RNA分离的额外手段。

二氧化硅材料包括玻璃颗粒，例如玻璃粉末、二氧化硅颗粒和研磨玻璃纤维滤纸制备的玻璃微纤维以及硅藻土在本领域中与例如离液盐的水性溶液组合使用，以将DNA与其他物质分离，并使DNA适合用于分子生物学过程。

玻璃颗粒、二氧化硅颗粒、硅胶及以上的混合物已被配制成各种不同形式，以制备能可逆结合核酸材料的基质，核酸材料在结合诱导剂，例如离液剂等存在下当与含有所述材料的介质接触时吸附在表面。这些基质设计成在基质接触外力，例如离心力或真空过滤时仍然维持核酸材料的吸附，从而将基质和其上吸附的核酸材料与剩余的介质组分分开。然后通常通过使基质接触洗脱溶液(例如水或洗脱缓冲液)从基质上洗脱核酸物质。许多商业来源提供基于二氧化硅的基质，其设计用于离心和/或过滤分离系统(例如来自QIAGEN(恰根，希尔登(Hilden)，德国)的核酸分离系统的和系列)。

已开发了磁力响应性颗粒(本文称作“磁性颗粒”)及其使用方法，用于分离核酸物质。文献中描述了设计用于核酸分离的几类不同的磁性颗粒，可购自商业来源。这些磁性颗粒通常归为两类，设计以可逆地直接结合核酸物质的，以及设计以间接(即通过至少一种中间物质)结合核酸物质的。本文将中间物质称为“标记物”。例如，一种常用的标记物是生物素化寡核苷酸脱氧胸腺嘧啶(oligo-dT)，与mRNA分子的聚腺苷尾在介质内形成氢键。

直接结合核酸的磁性颗粒通常基于二氧化硅，例如涂有磁力响应性硅氧化物的颗粒(也称作磁珠，例如以商标从恰根,希尔登,德国购得的那些；或以商标从普洛麦格(Promega)，麦迪逊(Madison)，美国购得的那些)。在结合诱导剂(例如离液盐，如盐酸胍或异氰酸胍)单独或组合结合添加剂(例如醇，如乙醇等)存在下核酸附着于这些颗粒。在颗粒分离后，如需要可将颗粒温育在水或具有低离子强度的缓冲液中轻易从颗粒洗脱吸附的核酸。

本领域已知数种不同的自动化分离磁性颗粒的方法。一种方法是将磁性或可磁化装置(例如杆)插入含有磁性颗粒的介质中，使磁性颗粒与磁性或可磁化装置结合，和除去磁性或可磁化装置。另外的方法是将磁性或可磁化装置置于盛有介质和磁性颗粒的容器之空间邻近处。磁性颗粒与容器壁结合，可除去介质而无需转移磁性颗粒。