[发明专利]从微藻中纯化重组骨桥蛋白的方法

说明书

本发明提供了从转基因微藻的培养物中获得经纯化的重组骨桥蛋白(rOPN)的方法，以及来自这些培养物的营养补充剂。

相关文献的交叉引用

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2016年11月27日提交的美国系列号62/426,567的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

背景技术

骨桥蛋白(OPN)是大约300个氨基酸的酸性多功能蛋白质，其在1979年首次被鉴定。由于广泛的翻译后修饰，骨桥蛋白以几种同种型存在。已经表征了从若干物种和来源获得的OPN进行了翻译后修饰。牛乳汁OPN具有28个磷酸化位点以及3个O-糖基化位点。略大的人乳汁OPN含有38个磷酸化位点和5个O-糖基化位点，而人尿液OPN也有5个O-糖基化位点，但只有31个磷酸化位点。大鼠骨OPN具有至少29个磷酸化位点，4个O-糖基化位点且具有酪氨酸硫酸化位点。由小鼠成骨细胞培养物分泌的骨桥蛋白具有27个磷酸化位点和5个O-糖基化位点。除了磷酸化位点的数量之外，同种型之间的磷酸化程度也不同。例如，尽管在奶牛乳汁OPN中所有28个磷酸化位点都被完全修饰，但是在人尿液OPN的31个磷酸化位点中仅约8个被修饰。此外，OPN含有RGD(精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸)整合素结合序列，其促进细胞与各种表面的附着。

自发现以来，OPN涉及许多生物学功能，包括细胞介导的免疫应答的激活、钙化的抑制，和新生儿免疫发育。在人类母乳中，OPN已被证明对婴儿免疫力至关重要。骨桥蛋白通过诱导T细胞分泌IL-12刺激T细胞分化成辅助T细胞1(Th-1)。已知Th-1细胞对于通过增强细菌或原生动物的吞噬作用来辅助巨噬细胞、改善病毒清除和最大化CD8T细胞的增殖是至关重要的。相反，OPN下调IL-10的分泌并限制辅助T细胞2(Th-2)的产生。骨桥蛋白还具有调理作用，其与病原体结合并标记它们以进行吞噬作用。这些因素表明了OPN在新生儿和婴儿肠道发育中的重要作用。

骨桥蛋白在婴儿免疫中的作用是众所周知的。以前的研究证明，奶牛乳汁与人类母乳中的OPN浓度之间存在差异。在一些研究中，OPN已被证明占人类母乳的10％。当将人乳汁中的OPN浓度与主要来源于牛乳汁的婴儿配方食品(infant formula)中的浓度进行比较时，这种差异进一步突出。因此，通过添加OPN可以改善婴儿配方食品模拟母乳营养价值的能力。目前，商业规模的唯一OPN来源是奶牛乳汁。然而，由于奶牛乳汁中低水平的OPN和纯化高成本的组合，使用奶牛乳汁来补充婴儿配方食品在商业上是不可行的。先前开发OPN的替代来源的尝试，诸如在大肠杆菌中产生的OPN，由于缺乏磷酸化而导致产生在生物学上无活性的蛋白质。

在过去的40年中，已经开发了重组蛋白表达系统以满足对蛋白质的不断增长的需求。然而，这些系统通常很昂贵，并且因此对于生产治疗中使用的高价值蛋白质有所保留。使用重组蛋白表达系统来生产具有营养价值的蛋白质的想法很少被考虑，主要是因为潜在的成本，特别是与广泛的蛋白质纯化相关的成本。在过去的10年中，对用于生物燃料的大规模和可负担的绿藻生产存在巨大的兴趣和相当大的投资。现在可以利用藻类遗传学、生长和生物燃料生产力方面的进步来生产重组蛋白质。

莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是真核绿藻，已被开发为重组蛋白表达系统很多年。已经对莱茵衣藻的核、叶绿体和线粒体基因组进行了测序和转化。具体而言，通过先进的蛋白质表达盒的开发以及对细胞器生物学的理解的增加，已将莱茵衣藻的叶绿体转变为稳健的表达系统。最近，绿藻的叶绿体已经用于表达磷酸化的生物活性OPN(美国专利申请公开号2016/0257730)。由于能够以商业规模生产重组OPN，因此需要一种能够纯化由微藻产生的OPN的经济上可行的方法。本发明提供了这样的方法。

发明内容