[发明专利]细胞微区室和制备方法

说明书

本发明涉及一种细胞微区室，其依次包含被组织在腔周围的：至少一层多能细胞，细胞外基质层，和水凝胶外层。本发明还涉及用于制备这样的细胞微区室的方法。

本发明涉及一种允许维持人类细胞多能性的细胞微区室。本发明还涉及一种用于获得这样的三维(3D)细胞培养区室的制备方法。

多能细胞被认为是重要的人类细胞资源，并且它们的培养日益受到关注，特别是在医学和制药领域。因此，大量生产多能细胞将满足制药工业所表达的新需求，这减少了动物模型的使用，有利于比目前使用的许多细胞系更相关的细胞模型。由制药公司开发的高通量试验已经使用大量的人类多能细胞。类似地，人类的组织工程和细胞疗法依赖于工业量的人类多能细胞的可用性。

目前，人类多能细胞通常在二维(2D)环境中、例如在陪替氏培养皿上培养，与细胞正常演化的3D介质非常不同。这些2D培养细胞的操纵通常是精细的，并且特别需要纯化、酶促脱离等步骤。此外，这些细胞难以储存并且冷冻后的存活率非常低。然而，使用常规运载工具发送大量冷冻的并与液体培养相容的多能细胞培养物的能力代表了对研究实验室和制药工业的主要挑战。

响应于这种情况，已经开发了三维培养系统，其特别致力于增加人类多能干细胞培养系统的通量、效率和质量。

然而，现有的3D培养系统并不完全令人满意。经常观察到不受控制的融合现象，产生细胞聚集体，所述细胞聚集体的大小(直径>200μm)使得培养基的扩散不充分。因此，在这样的3D培养系统内，难以控制细胞分化和/或细胞死亡率很高。通常，源自于3D细胞培养的产物缺乏同质性和这种技术的成本使得该技术与2D培养相比没有竞争力，然而2D培养并不令人满意。

因此需要一种3D细胞培养系统，其能够提供具有受控表型的大量多能细胞，所述细胞可容易地用于基础研究和工业上。

发明内容

在开发用于3D细胞培养的细胞微区室的同时，本发明人开发了一种系统，其允许人类多能细胞的大量液体悬浮培养，同时维持所述细胞的表型。开发的微区室允许利用2D培养中常规使用的培养基在液体培养基中培养细胞，同时保护细胞并控制它们的表型以避免野生型分化并维持多能性。更确切地说，由本发明人开发的微区室或囊依次包含以基本上同心的方式组织的水凝胶壳、细胞外基质层、和一层或多层围绕中央腔的人类多能细胞。与现有培养系统不同，本发明的囊的水凝胶壳保护细胞免受与液体悬浮培养期间的碰撞或融合相关的机械应力。特别有利地，本发明的微区室的“包囊”中的组织化允许它们以高细胞存活率冷冻。此外，细胞可以在使用前直接在所述微区室内分化，或在多能性阶段用于3D和2D培养。本发明人还开发了用于制备这样的细胞微区室的方法，保证获得并维持所述包囊形式，其既适用于冷冻它们所含的细胞又适用于控制所述细胞的表型。

因此，本发明的主题是一种细胞微区室，其依次包含被组织在腔周围的：

-至少一层人类多能细胞；

-细胞外基质层；

-水凝胶外层。

有利地，培养基填充所述层之间留下的空间。

本发明的另一个主题是一种用于制备本发明的细胞微区室的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在含有RHO/ROCK途径抑制剂的培养基中温育人类多能干细胞；

(b)将来自步骤(a)的多能干细胞与细胞外基质混合；

(c)将来自步骤(b)的混合物囊封在水凝胶层中；

(d)将步骤(c)中获得的囊在含有RHO/ROCK途径抑制剂的培养基中培养；

(e)清洗来自步骤(d)的囊以除去所述RHO/ROCK途径抑制剂；

(f)将来自步骤(e)的囊在不含RHO/ROCK途径抑制剂的培养基中培养3至20天，优选5至10天，并任选回收所获得的细胞微区室。