[发明专利]改进的色谱树脂、其生产和应用

说明书

本发明涉及色谱领域，更具体地说，涉及生产蛋白亲和色谱树脂，其包含基于断裂内蛋白(例如来自点形念珠藻(Nostoc punctiforme)的DnaE)的N‑末端片段的亲和配体，以及使用所述蛋白亲和色谱树脂的方法。所述N‑末端片段在细菌细胞的包涵体中产生。

发明领域

本发明涉及色谱领域，更具体地说，涉及生产蛋白亲和色谱树脂，其包含基于断裂内蛋白(例如来自点形念珠藻(Nostoc punctiforme)的DnaE)的N-末端片段的亲和配体，以及使用所述蛋白亲和色谱树脂的方法。

发明背景

许多方法可用于蛋白纯化，例如色谱，其包括各种技术，这些技术利用了各种蛋白之间由于其内在性质导致的一种或多种差异。这些性质很大程度上由每种蛋白质独特的氨基酸序列决定，如蛋白大小、电荷、疏水性、生物活性或特异性结合亲和力。在纯化过程中，通常需要进行过滤和色谱的组合(在使用不同的树脂载体的一个或几个步骤中)，以达到靶蛋白(或感兴趣的蛋白质)的足够纯度。此外，导致某一种靶蛋白的足够纯度的某一种纯化过程可能不适合于另一种不同的靶蛋白。因此，在以纯形式需要多种不同蛋白的应用中，使用亲和标记系统用于亲和色谱是一种有吸引力的选择。亲和标记通常是通过基因工程与靶蛋白融合的肽或蛋白。此外，亲和标记具有已知的亲和配体，使得可以以可预测的方式在合适的亲和树脂上快速纯化生成的融合蛋白，其中系统优选对蛋白水解是稳定的，并且不含有任何半胱氨酸，其否则会干扰融合的靶蛋白内二硫键的形成。通常，从减少任何靶蛋白稳定性问题的角度来看，在尽可能短的时间内纯化蛋白是需要的。此外，简化纯化过程以提高蛋白产量和降低总成本是需要的。

已经描述了大量不同的亲和标记融合系统，例如，常用的亲和标记是聚组氨酸标记，它包括附加在靶蛋白氨基酸序列的任一侧上的两个或更多个连续的组氨酸的序列。聚组氨酸标记融合蛋白通常使用固定化金属离子色谱(IMAC)树脂或滤器纯化，其中配体由与固定的螯合物络合的二价金属离子例如Ni2⁺-离子组成。除了聚组氨酸标记外，文献中也有大量关于各种基于较小肽或较大蛋白的亲和标记的例子。即使亲和标记融合蛋白的纯度对于其他不想要的蛋白或非蛋白污染物来说是足够的，但亲和标记也可能存在缺点，因为它们在纯化后仍然与靶蛋白融合，而且亲和标记可能干扰后续的研究。亲和标记可改变或影响靶蛋白的结构和功能，并且还可能产生其他不需要的影响，特别是在体内使用时。因此，对于某些应用，可能需要在纯化后除去亲和标记，例如，如果亲和标记引起免疫反应或改变靶蛋白的结构或功能特性的话。从靶蛋白中除去亲和标记的一个解决方案是插入特定的氨基酸识别序列，以通过利用某些化学试剂、酶或蛋白酶在亲和标记和靶蛋白之间将肽键裂解。然而，无效或非特异性的裂解是潜在的缺点。此外，化学试剂或蛋白酶的使用可能是昂贵的，特别是在规模较大的过程中。此外，这种除去亲和标记的方法可能需要在纯化过程中额外的步骤以获得最佳的裂解条件和随后除去添加的化学物质或蛋白酶。

除去亲和标记的另一种方法是在亲和标记和靶蛋白之间插入一种自裂解酶。这使得在响应酶促自裂解事件时靶蛋白能够从亲和凝胶树脂洗脱，将酶和亲和标记留在凝胶树脂上。基于内蛋白的亲和标记系统可用于在无需添加化学试剂或蛋白酶的单一纯化步骤中纯化无标记靶蛋白。内蛋白是在称为蛋白剪接的自然过程中从较大的线性蛋白序列中自我切割出来并加入侧翼序列(N-/C-外蛋白)的酶。内蛋白也可被用来引入羧基-端蛋白硫酯，以用于称为表达蛋白连接的技术中(Muir TW, Sondhi D, Cole PA. Proc Natl Acad SciUSA. 1998;95:6705)。一些内蛋白的关键催化残基的突变可将这些内蛋白转化为适合在蛋白质纯化中除去标记的自裂解酶(Gene 231:1-13)。内蛋白系统的一个优点是重组的无标记蛋白可以用亲和色谱在单一步骤中纯化。缺点往往可能是裂解动力学，使得要达到足够的裂解水平并因此获得足够的无标记靶蛋白产量，孵育可能需要孵育16小时或更长时间。此外，在宿主细胞中开始表达后，酶促内蛋白活性将已经存在，这可能导致不需要的过早裂解，并因此导致靶蛋白产量的下降。